通用型CAR-T細胞及其制備方法和用途技術

通用型CAR?T細胞及其制備方法和用途。本發明專利技術提供了一種通用型CAR?T細胞，其表達特異性CAR并且不表達TCR。本發明專利技術還提供了一種制備通用型CAR?T細胞的方法，所述方法包括如下步驟：1)在T細胞中引入sgRNA分子和Cas9分子；2)在所述T細胞中引入CAR分子；其中，步驟2)可在步驟1)之前、之后或同時進行，并且所述sgRNA分子包含與來自TCR的a鏈或β鏈恒定編碼區(即TRAC或TRBC)基因的靶區域互補的靶向結構域。本發明專利技術的通用型CAR?T細胞避免了轉導的T細胞出現GVHD以及潛在的TCR受體信號干擾。

【技術實現步驟摘要】
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本專利技術涉及免疫學和分子生物學領域，具體地涉及腫瘤免疫療法，尤其是一種通用型CAR-T細胞及其制備方法和用途。·
技術介紹
腫瘤免疫療法近年來得到廣泛的關注和應用，尤其是CAR-T(chimericantigenreceptor-engineeredTcells)技術的出現，使人類對腫瘤的控制得到了里程碑式的發展。該技術在腫瘤治療中的應用始于1989年。它的臨床應用結果讓人看到治愈癌癥的曙光：不僅僅在急性或者慢性淋巴細胞血液病中可以創造奇跡，在其它一些實體瘤比如淋巴瘤、成神經細胞瘤中也有著令人興奮的治療效果。目前CAR-T技術中所應用的T細胞主要來源于患者自身，從患者自身外周血來源的T細胞經過激活、CAR導入并擴增，然后回輸到患者體內。但是很多情況下，由于病人的病情危險或者患者自身的條件不允許再從其體內抽出外周血進行CAR-T細胞的治療；甚至是即使病人可以提供外周血，但是從血中分選出來的T細胞活性不足以進行CAR改造，這就從一定范圍上限制了CAR-T技術的應用范圍。為了解決這個問題，異體CAR-T逐漸成為一個良好的選擇。同時，異體CAR-T技術解決了T細胞的來源問題也將為CAR-T的商業化推廣奠定基礎。在機體內，T細胞捕獲并消滅異源抗原是一個復雜的過程，需要主要組織相容性復合物(MHC)和T細胞受體(TCR)的共同參與，其中TCR在識別MHC結合的抗原過程中起著關鍵作用。主要組織相容性復合物(MHC)有兩種類型，通常稱為MHCI類和MHCII類，除了具有抗原遞呈作用，還與器官移植過程中的排斥反應相關。殺傷性T細胞則是通過其表面具有的類似抗體的分子即T細胞受體(TCR)識別并清除經MHCI類分子遞呈的抗原。在同種異體環境中，CAR-T上的TCR信號傳導作用可能對臨床應答產生潛在的影響，而TCR和CAR之間的相互作用尚未有深入的研究。同時，回輸異體CAR-T細胞有可能出現移植物抗宿主病(GVHD)的風險。因此，需要有降低受體的供體細胞排斥反應和避免出現GVHD的改善CAR-T療效的方法。·
技術實現思路
本專利技術針對上述缺陷，利用CRISPR/Cas9技術對來自健康志愿者(donor)的T細胞進行修飾，選擇性敲除內源性T細胞受體(TCR)的a鏈和/或β鏈恒定編碼區(TRAC和/或TRBC)基因，同時將嵌合抗原受體(CAR)穩定表達在T細胞中，從而獲得了表達特異性CAR同時不表達TCR的CAR-T細胞。本專利技術的第一方面提供了一種通用型CAR-T細胞，其表達特異性CAR并且不表達TCR。本專利技術的第二方面提供了一種制備通用型CAR-T細胞的方法，所述方法包括如下步驟：1)在T細胞中引入sgRNA分子和Cas9分子；2)在所述T細胞中引入CAR分子；其中，步驟2)可在步驟1)之前、之后或同時進行，并且所述sgRNA分子包含與來自TCR的a鏈或β鏈恒定編碼區(即TRAC或TRBC)基因的靶區域互補的靶向結構域。本專利技術的第三方面提供了包含本專利技術第一方面的通用型CAR-T細胞的組合物。本專利技術的第四方面提供了本專利技術第一方面的通用型CAR-T細胞用于制備治療腫瘤的藥物的用途。本專利技術的通用型CAR-T細胞避免了輸注到患者體內的T細胞出現GVHD以及潛在的TCR受體信號干擾。本申請將會為通用型CAR-T細胞的使用鋪平道路，具有重大的臨床意義。·附圖說明根據以下參照附圖進行的詳細描述，本專利技術的上述和其他方面、特征和優點會變得更加清楚。圖1示出了sgRNA表達質粒及Cas9表達質粒在不同轉染(脂質體轉染、電轉和慢病毒轉染)條件下的轉染效率的比較結果。圖2a和圖2b示出了不同sgRNA造成基因組突變的效率的比較結果。圖3示出了對經TCR敲除的TRAC和TRBC區域進行測序的結果。圖4示出了對預測的TRAC-sg3潛在的人基因組上的脫靶位點進行測序的結果。圖5示出了對TCR陰性、CD4和CD8陽性的T細胞的篩選結果。圖6示出了T細胞、WTCAR-T和TCR-CAR-T細胞對靶細胞的殺傷效果的比較結果。圖7示出了T細胞、WTCAR-T和TCR-CAR-T細胞抑制以及殺死腫瘤細胞的效果的比較結果。圖8示出了注射小鼠T細胞、人WTCAR-T和人TCR-CAR-T細胞后，小鼠平均體重的變化的比較結果。·具體實施方式如上所述，本專利技術的第一方面提供了一種通用型CAR-T細胞，其表達特異性CAR并且不表達TCR。在一個實施方案中，所述細胞來源于健康志愿者(或供者)。在一個實施方案中，本專利技術的通用型CAR-T細胞的TCR基因被敲除。在一個具體的實施方案中，所述TCR的a鏈和/或β鏈恒定編碼區(即TRAC和/或TRBC)基因被敲除。TRAC和TRBC基因可以被全部敲除，也可以被部分敲除；可以二者均被敲除，也可以敲除二者之一；只要敲除后細胞不能表達有活性的TCR即可。在一個具體的實施方案中，所述TCR的a鏈恒定編碼區(即TRAC)基因被敲除。例如，在具體實施方案中，本專利技術TCR的a鏈恒定編碼區基因被引入所述細胞的TRAC-sg1-7分子之一(見表1)以及Cas9分子部分或全部敲除；優選，所述TCR的a鏈恒定編碼區基因被引入細胞的TRAC-sg3分子以及Cas9分子敲除。在另一個具體的實施方案中，所述TCR的β鏈恒定編碼區(即TRBC)基因被敲除。例如，在具體實施方案中，本專利技術TCR的β鏈恒定編碼區基因被引入所述細胞的TRBC-sg1-7分子之一(見表1)以及Cas9分子部分或全部敲除；優選，所述TCR的β鏈恒定編碼區基因被引入細胞的TRBC-sg1分子以及Cas9分子敲除。在一個實施方案中，本專利技術的通用型CAR-T細胞所表達的CAR可以是本領域已知的任何CAR，只要其能夠使T細胞以人白細胞抗原-非依賴性的方式識別細胞表面抗原，發揮殺傷作用即可。例如，可以使用中國專利技術專利申請201510324558.X中公開的CAR，本專利技術的具體實施方案中使用的CAR可參考該專利技術專利申請公開文本。具體而言，本專利技術的CAR-T細胞中表達的CAR包含順序連接的信號肽、胞外結合區、任選的鉸鏈區、跨膜區和胞內信號區。本文使用的術語“信號肽”是指引導新合成的蛋白質向分泌通路轉移的短(長度5-30個氨基酸)肽鏈。在本專利技術中，可以使用人體內的各種蛋白質的信號肽，例如體內分泌的細胞因子蛋白、白細胞分化抗原(CD分子)的信號肽。在一個具體的實施方案中，所述信號肽為GMCSF信號肽，其核苷酸序列如專利技術專利申請201510324558.X的序列表中的SEQIDNo:1所示。在一個具體的實施方案中，所述信號肽為CD8信號肽，其核苷酸序列如專利技術專利申請201510324558.X的序列表中的SEQIDNo:2所示。在本專利技術中，所述鉸鏈區可以使用各種不同抗體或抗原受體的鉸鏈區，特別是CD分子的鉸鏈區。在一個具體的實施方案中，所述鉸鏈區可以選自CD8或CD28等蛋白的鉸鏈區。所述CD8或CD28是T細胞表面的天然標記物。在一個具體的實施方案中，所述鉸鏈區為CD8鉸鏈區(CD8-hinge)，其核苷酸序列如專利技術專利申請201510324558.X的序列表中的SEQIDNo:6所示。在一個具體的實施方案中，所述鉸鏈區為CD28鉸鏈區(CD28-hinge)，其核苷酸序列如專利技術專利申請2本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種通用型CAR?T細胞，其表達特異性嵌合抗原受體(CAR)并且不表達T細胞受體(TCR)。

【技術特征摘要】
1.一種通用型CAR-T細胞，其表達特異性嵌合抗原受體(CAR)并且不表達T細胞受體(TCR)。2.權利要求1的通用型CAR-T細胞，其中所述細胞來源于健康志愿者(或供者)。3.權利要求1或2的通用型CAR-T細胞，其中所述TCR的編碼基因被敲除；優選地，所述TCR的a鏈和/或β鏈恒定編碼區(即TRAC和/或TRBC)基因被敲除；更優選地，所述TCR的a鏈和/或β鏈恒定編碼區基因被引入所述細胞的TRAC-sg1-7分子之一和/或TRBC-sg1-7分子之一以及Cas9分子敲除；最優選地，所述TCR的a鏈和/或β鏈恒定編碼區基因被引入細胞的TRAC-sg3分子和/或TRBC-sg1分子以及Cas9分子敲除。4.權利要求1-3中任一項的通用型CAR-T細胞，其中所述CAR包含順序連接的信號肽、胞外結合區、任選的鉸鏈區、跨膜區和胞內信號區；優選地，所述信號肽的核苷酸序列如發明專利申請201510324558.X的序列表中SEQIDNo:1或SEQIDNo:2所示；優選地，所述胞外結合區的核苷酸序列如發明專利申請201510324558.X的序列表中SEQIDNo:4或SEQIDNo:5所示；優選地，所述鉸鏈區的核苷酸序列如發明專利申請201510324558.X的序列表中SEQIDNo:6或SEQIDNo:7所示；優選地，所述跨膜區的核苷酸序列如發明專利申請201510324558.X的序列表中SEQIDNo:8或SEQIDNo:9所示；優選地，所述胞內信號區的核苷酸序列如發明專利申請201510324558.X的序列表中SEQIDNo:10、SEQIDNo:11或SEQIDNo:12所示。5.權利要求4的通用型CAR-T細胞，其中所述...

【專利技術屬性】
技術研發人員：何霆，魯薪安，尤亞南，胡雪蓮，
申請(專利權)人：北京藝妙神州醫療科技有限公司，
類型：發明
國別省市：北京;11