一種基于黃牛Angptl8基因單核苷酸多態(tài)性的分子育種方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種基于黃牛Angptl8基因單核苷酸多態(tài)性的分子育種方法，以包含Angptl8基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛Angptl8基因，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶Hinf?I消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物片段，對(duì)酶切產(chǎn)物片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定出黃牛Angptl8基因第-308位具有單核苷酸多態(tài)性，同時(shí)，將黃牛Angptl8基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果與黃牛的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，并將合適的基因型用于提高黃牛生長(zhǎng)性狀的分子育種，有助于快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于分子生物學(xué)
，具體涉及一種基于黃牛Angptl8基因單核苷酸多態(tài)性的分子育種方法。
技術(shù)介紹
單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)是指基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性，通常所說(shuō)的SNP包括堿基的替換、插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。在二倍體生物群體中，SNP理論上可由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上3個(gè)或4個(gè)等位基因的SNP很罕見(jiàn)，故SNP通常被稱為二等位基因分子標(biāo)記。根據(jù)SNP在基因組中分布的位置，SNP又可劃分為基因編碼區(qū)SNP(cSNP)、基因周邊SNP(pSNP)和基因間SNPs(iSNP)等類型。其中cSNP造成的影響較大，可能影響到蛋白質(zhì)的功能。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，5’側(cè)翼區(qū)的SNPs，即pSNP對(duì)基因的功能也具有非常重要的調(diào)控作用，能夠影響整個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄效率。分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種(MolecularMark-AssistSelection，MAS)，是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的方法，借助DNA分子標(biāo)記對(duì)遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對(duì)畜禽的綜合性狀進(jìn)行品種改良，實(shí)現(xiàn)新品種的選育。標(biāo)記輔助選擇主要經(jīng)歷了三個(gè)階段：第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋白質(zhì)(酶)標(biāo)記對(duì)數(shù)量性狀的標(biāo)記階段；第三個(gè)階段是分子遺傳標(biāo)記階段。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的日漸成熟與豐富，覆蓋整個(gè)基因組的標(biāo)記越來(lái)越多，通過(guò)與QTL(quantitativetraitlocus)間的連鎖分析，可間接實(shí)現(xiàn)輔助選擇性狀的目的。SNP作為新的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。在肉牛育種中，人們期望通過(guò)對(duì)與生長(zhǎng)性狀有密切相關(guān)、并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記進(jìn)行選擇，達(dá)到早期選種和提高育種值準(zhǔn)確性的目的，從而在畜禽育種中獲得較大的研究進(jìn)展。目前，主要采用幾種不同的路線來(lái)篩別SNP：包括DNA序列測(cè)定方法、PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法、AS-PCR方法、引物延伸法、寡核苷酸連接反應(yīng)、PCR-RFLP或forced-PCR-RFLP方法等。在這些SNPs檢測(cè)技術(shù)中，DNA序列測(cè)定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法，但是其檢測(cè)費(fèi)用昂貴，需要有DNA測(cè)序儀等大型儀器，同時(shí)需要非常熟練的技術(shù)人員和豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此該方法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想SNPs檢測(cè)方法；利用PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法檢測(cè)SNP可以適當(dāng)降低檢測(cè)費(fèi)用，但是，PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較長(zhǎng)，操作比較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在假陽(yáng)性問(wèn)題，所以，也并非理想的SNP檢測(cè)手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNPs檢測(cè)方法，在未來(lái)的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計(jì)特別的引物，且只能針對(duì)特定的基因位點(diǎn)，同時(shí)，檢測(cè)過(guò)程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)于一般的分子實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)可實(shí)施性不強(qiáng)。綜上所述，利用PCR-RFLP或forced-PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行SNP檢測(cè)可能是當(dāng)前檢測(cè)SNP最理想的遺傳標(biāo)記方法。本試驗(yàn)中的forced-PCR-RFLP是在發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后通過(guò)對(duì)引物中引入錯(cuò)配堿基，使之與SNP位點(diǎn)共同構(gòu)成酶切位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)基因分型的一種方法。通過(guò)PCR擴(kuò)增，使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNPs位點(diǎn)。該方法既具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，是目前可實(shí)際應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的方法。血管生成素樣蛋白(Angiopoietin-likeproteins，Angptls)是一類既與血管生成有關(guān)，又與脂類、葡萄糖、能量代謝和胰島素敏感性密切相關(guān)的分泌性蛋白質(zhì)因子，先后發(fā)現(xiàn)了該家族的8個(gè)成員，命名為Angptl1-8。其中Angptl8是最近發(fā)現(xiàn)的能在肝臟和脂肪組織中表達(dá)并具有多種功能的活性多肽，又稱為促胰島生長(zhǎng)素(betatrophin)。在人類及小鼠中，Angptl8是一種由198個(gè)氨基酸組成的22kD的分泌蛋白。在培養(yǎng)的肝細(xì)胞中，Angptl8可促進(jìn)Angptl3的剪切，釋放出Angptl3的N端，該N端結(jié)構(gòu)域可抑制脂蛋白脂肪酶的活性。另有研究表明，在小鼠中單獨(dú)表達(dá)Angptl3不會(huì)改變血漿中三酰甘油的水平，而與Angptl8共表達(dá)后將引起高甘油三酯血癥；免疫共沉淀的結(jié)果顯示Angptl8與Angptl3的N端結(jié)構(gòu)域存在一定的相互作用，Angptl8可能是通過(guò)激活A(yù)ngptl3調(diào)節(jié)血漿中的甘油三酯水平。采用Angptl8基因缺失的小鼠做模型時(shí)也發(fā)現(xiàn)Angptl8基因缺失可嚴(yán)重?cái)_亂甘油三酯的新陳代謝，重組Angptl8蛋白還會(huì)抑制LPL的活性。以上研究表明Angptl8是脂類、葡萄糖和能量代謝的調(diào)制器，在糖脂代謝方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。SNP多態(tài)性的檢測(cè)方法，最常見(jiàn)的有單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)和直接測(cè)序等，但是，單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)操作繁瑣，影響因素較多，容易出現(xiàn)假陰性問(wèn)題，而直接測(cè)序法成本較高。加之，中國(guó)地方黃牛Angptl8基因遺傳變異的研究仍是空白。因此，有必要探索一種可以快速檢測(cè)基因組DNA序列中的單核苷酸多態(tài)性，以及基于該多態(tài)性的分子育種方法，用以改良我國(guó)地方黃牛品種。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種基于黃牛Angptl8基因單核苷酸多態(tài)性的分子育種方法，尋找與黃牛生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)的SNP作為分子標(biāo)記，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀黃牛種群的建立。本專利技術(shù)一種基于黃牛Angptl8基因單核苷酸多態(tài)性的分子育種方法，以包含Angptl8基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛Angptl8基因，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；用限制性內(nèi)切酶HinfI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物片段；對(duì)酶切產(chǎn)物片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定出黃牛Angptl8基因中第-308位具有單核苷酸多態(tài)性，所述單核苷酸多態(tài)性為：TT基因型表現(xiàn)為148bp一條條帶；CC基因型表現(xiàn)為132bp和16bp兩條條帶；TC基因型表現(xiàn)為148bp、132bp和16bp三條條帶；分別分析TT基因型與黃牛生長(zhǎng)性狀、CC基因型與黃牛生長(zhǎng)性狀、TC基因型與黃牛生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，得出TT基因型有利于黃牛生長(zhǎng)性狀的提高；將TT基因型作為提高黃牛生長(zhǎng)性狀的分子遺傳標(biāo)記本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種基于黃牛Angptl8基因單核苷酸多態(tài)性的分子育種方法，其特征在于，以包含Angptl8基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛Angptl8基因，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；用限制性內(nèi)切酶HinfI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物片段；對(duì)酶切產(chǎn)物片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定出黃牛Angptl8基因中第?308位具有單核苷酸多態(tài)性，所述單核苷酸多態(tài)性為：TT基因型表現(xiàn)為148bp一條條帶；CC基因型表現(xiàn)為132bp和16bp兩條條帶；TC基因型表現(xiàn)為148bp、132bp和16bp三條條帶；分別分析TT基因型與黃牛生長(zhǎng)性狀、CC基因型與黃牛生長(zhǎng)性狀、TC基因型與黃牛生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，得出TT基因型有利于黃牛生長(zhǎng)性狀的提高；將TT基因型作為提高黃牛生長(zhǎng)性狀的分子遺傳標(biāo)記，用于黃牛的分子育種；所述引物對(duì)P包括上游引物P1和下游引物P2，其中，上游引物P1的堿基序列為：5′?GGGGCAGCTCCGGGTGAAT?3′；下游引物P2的堿基序列為：5′?GGGCACTGGTGAGAGGATAGGC?3′。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于黃牛Angptl8基因單核苷酸多態(tài)性的分子育種方法，其特征在
于，
以包含Angptl8基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，
PCR擴(kuò)增黃牛Angptl8基因，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
用限制性內(nèi)切酶HinfI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得酶切產(chǎn)物片段；
對(duì)酶切產(chǎn)物片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；
根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定出黃牛Angptl8基因中第-308位具有單
核苷酸多態(tài)性，所述單核苷酸多態(tài)性為：TT基因型表現(xiàn)為148bp一條條帶；
CC基因型表現(xiàn)為132bp和16bp兩條條帶；TC基因型表現(xiàn)為148bp、132bp
和16bp三條條帶；
分別分析TT基因型與黃牛生長(zhǎng)性狀、CC基因型與黃牛生長(zhǎng)性狀、TC基
因型與黃牛生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，得出TT基因型有利于黃牛生長(zhǎng)性狀的提高；
將TT基因型作為提高黃牛生長(zhǎng)性狀的分子遺傳標(biāo)記，用于黃牛的分子育
種；
所述引物對(duì)P包括上游引物P1和下游引物P2，其中，
上游引...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馬云，付瑋瑋，李芬，郝瑞杰，李俊雅，陳寧博，黃潔萍，韓爽，劉云云，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：信陽(yáng)師范學(xué)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：河南;41