本發明專利技術公開了一種具有神經保護作用的寡核苷酸、藥物組合物及其醫藥用途。所述寡核苷酸的序列如SEQ?ID?NO：1所示。所述寡核苷酸經3’端膽固醇修飾，5’端兩個硫代骨架修飾，3’端四個硫代骨架修飾，全鏈甲氧基修飾。本發明專利技術將寡核苷酸與可接受的藥學載體組成藥物組合物，通過靜脈、肌肉或腹腔注射等用來治療與缺血性神經元損傷有關的疾病，尤其針對缺血性腦卒中。本發明專利技術的寡核苷酸在大鼠全腦缺血和局灶性腦缺血后應用可以明顯減輕缺血再灌注引起的腦損傷，具有良好的藥物應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫學領域，涉及一種寡核苷酸，尤其涉及一種具有神經保護作用的寡核苷酸、藥物組合物及其醫藥用途。
技術介紹
腦卒中(Stroke)是威脅人類生命的主要危險因素，它是一種由急性腦循環障礙所致的腦功能缺損綜合征，具有高發病率，高死亡率、高致殘率的特點，且發病率呈逐年上升趨勢。急性缺血性腦卒中是腦供血不足導致的腦組織壞死，占全部腦卒中的60％－80％。目前，急性缺血性腦卒中在臨床上常見的治療方法是采用溶栓藥恢復或改善血供，同時需配合神經保護藥物阻止腦缺血的進一步發展，但目前臨床上神經保護藥物的療效和安全性仍不理想。故積極探索腦缺血再灌注神經損傷的分子機制，篩選藥物作用靶點，尋找更有效的神經保護藥物，具有重要的醫學價值和社會意義。寡核苷酸是生物醫學領域研究和治療的一種新型基因靶向治療藥物，在多種疾病的治療中具有良好的應用前景。寡核苷酸，或經修飾的藥物組合物與細胞膜親和力更強，藥效明顯，具有更高的穩定性和特異性，且不易產生耐藥性，可以作為治療中樞神經系統疾病的一種手段。
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種寡核苷酸，可用于治療缺血再灌注造成的神經元損傷。為實現上述目的，本專利技術提供了一種具有神經保護作用的寡核苷酸，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。所述的寡核苷酸由化學合成方法制備，可以經過不同的化學修飾。所述的寡核苷酸經3’端膽固醇修飾，5’端兩個硫代骨架修飾，3’端四個硫代骨架修飾，全鏈甲氧基修飾。本專利技術的另一個目的是提供一種藥物組合物，可用于治療缺血再灌注造成的神經元損傷。本專利技術提供的藥物組合物，包含活性成分的寡核苷酸以及藥學上可接受的載體。所述載體可以選自稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入調味劑、香味劑等。本專利技術的藥物組合物可以制成片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液及注射液等多種形式。上述各種劑型均可以按照藥學領域的常規方法制備。本專利技術的再一個目的是提供所述寡核苷酸的醫藥用途，可用于制備治療神經系統疾病的藥物和神經元保護藥物。其中，所述的神經系統疾病指與缺血性神經元損傷有關的神經系統疾病，如缺血性腦卒中。本專利技術提供的寡核苷酸可以明顯減輕缺血再灌注引起的腦損傷，治療與缺血性神經元損傷有關的疾病，其在醫學領域、尤其是神經醫學領域具有良好的應用前景。附圖說明圖1顯示了本專利技術的寡核苷酸對大鼠全腦缺血再灌注引起的海馬神經元損傷的影響(A：大鼠腦組織石蠟切片的焦油紫染色圖；B：A的統計圖)；圖2顯示了本專利技術的寡核苷酸對大鼠局灶性腦缺血再灌注引起的腦損傷的影響(A1：大鼠MCAO腦組織TTC染色圖；A2：A1的統計圖；B：動物神經行為學Longa評分)。具體實施方式下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。實施例1寡核苷酸的制備本專利技術的寡核苷酸由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，經3’端膽固醇修飾，5’端兩個硫代骨架修飾，3’端四個硫代骨架修飾，全鏈甲氧基修飾，紫外定量后真空干燥，-20℃保存備用。經化學修飾的寡核苷酸增加了其穩定性和靶向親和性，降低了細胞毒性，可通過靜脈，肌肉或腹腔注射等，能夠達到生物治療缺血性腦損傷的目的。通過與GeneBank聯機blast序列比對，得寡核苷酸序列如SEQIDNO：1所示：5’-AGUGAAUUCUACCAGUGCCAUA-3’，其具有很好的特異性。實施例2寡核苷酸對大鼠全腦缺血再灌注引起的海馬神經元損傷的影響(1)主要試劑陰性對照的寡核苷酸由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。異氟烷(2％)購自美國Baxter公司；水合氯醛及其他常規化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司；2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)購自Ameresco公司。(2)主要儀器小動物麻醉機(ABS-100)、小動物誘導箱(IC-R)購自上海玉研科學儀器有限公司；小動物立體定位儀購自美國STOELTING公司。(3)實驗動物SPF級Sprague-Dawley(SD)健康雄性大鼠，體重為220-300g，由徐州醫科大學實驗動物中心提供，飼養于SPF級動物房，許可證號：SCXK(蘇)2015-0009。(4)實驗分組建立假手術組，缺血再灌注5天組，缺血加寡核苷酸組，缺血加陰性對照組，單純寡核苷酸組。其中假手術組同實驗組一樣建立全腦缺血模型，但不進行缺血，不注射任何藥物；缺血再灌注5天組同實驗組一樣建立全腦缺血模型，同樣進行缺血15min，但不注射任何藥物；缺血加寡核苷酸組和缺血加陰性對照組是在缺血后50min分別完成側腦室注射寡核苷酸和陰性對照；單純寡核苷酸組是不缺血但側腦室注射寡核苷酸。(5)實驗方法采用四動脈結扎法，參照LiuY等人(BrainRes，2001，909：51-58)建立SD大鼠四動脈結扎全腦缺血模型，其中全腦缺血15min，在缺血再灌注50min后完成側腦室注射寡核苷酸或對照藥物。在腦缺血再灌注第5天，焦油紫染色觀察注射藥物對缺血再灌注損傷后海馬CA1區錐體神經元存活的影響。具體操作如下：雄性SD大鼠以20％水合氯醛(0.15ml/kg)腹腔注射麻醉，固定在電凝器上，電凝雙側椎動脈，分離雙側頸動脈，24h后在大鼠清醒狀態下，使用動脈夾夾閉雙側頸動脈，15min之后取下動脈夾，恢復頸部血流供應，再灌注計時從取下動脈夾的時間開始。假手術組給予相同的處理，但是不夾閉雙側頸動脈。缺血過程保持大鼠直腸溫度在36.5℃-37.5℃之間。模型構建成功參考指標：(1)1min內意識喪失，翻正反射消失，失去活動能力，四肢和尾巴僵直；(2)雙側瞳孔放大眼球發白，再灌注后眼球立即恢復粉紅色、瞳孔縮回。側腦室注射方法：按侯筱宇等人建立的方法(Neuroscilett,2003,343：125-128)。異氟烷麻醉大鼠，給予實驗動物吸入2％異氟烷進行誘導麻醉，由呼吸機控制通氣，保持正常呼氣末O2和CO2濃度，麻醉后固定于小動物立體定位儀上，切開頭皮暴露顱骨，使其保持水平位置，H2O2燒灼暴露前囟點，鉆頭鉆孔，位置為前囟后0.8mm，旁開1.5mm，微量注射針插入，深度為從顱骨表面向下3.5mm。注射速率：1μl/min，體積為10μl，注射完后留針10min。適量無核酶水溶解寡核苷酸或陰性對照，使用前用等體積轉染試劑(SantaCruz,sc-29528)混勻，每只大鼠腦室注射寡核苷酸或陰性對照0.1nmol。灌注取腦方法：大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，打開胸腔暴露心臟，將針頭從左心尖穿過左心室插入主動脈，剪開右心耳，用200ml左右生理鹽水快速沖洗，至流出的生理鹽水中沒有血跡，換冰冷的4％多聚甲醛灌注，用量約為300ml，30min之內灌結束，灌注結束大鼠斷頭取腦，置于4％多聚甲醛中4℃進行后固定。焦油紫染色方法：取出固定好的腦塊，用流水沖洗，然后以70％(3d)、80％(1d)、90％(12h)、95％(2h×2次)、100％(1h×2次)梯度酒精脫水；二甲苯：乙醇(1:1)(30min)、二甲苯(30min)透明；60℃浸蠟(6h)；取出腦塊包埋；包埋好的蠟塊置4本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種具有神經保護作用的寡核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技術特征摘要】
1.一種具有神經保護作用的寡核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根據權利要求1所述的具有神經保護作用的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸經過化學修飾。3.根據權利要求2所述的具有神經保護作用的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸經過3’端膽固醇修飾，5’端兩個硫代骨架修飾，3’端四個硫代骨架修飾，全鏈甲氧基修飾。4.一種藥物組合物，其特征在于，包含活性成分的權利要求1至3任一項所述的寡核苷酸以及藥學上可接受的載體。5.根據權利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學上可接受的載體選自稀釋劑、賦形劑、填...
【專利技術屬性】
技術研發人員：侯筱宇，魏建峰，姚桂英，周婷婷，魏濤，岳軍，
申請(專利權)人：徐州醫科大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
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