一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒及其應用制造技術

本發明專利技術涉及一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒及其應用。本發明專利技術盒體內的物質包括檢測PEAR1基因上的rs2768759號位點的特異性引物及特異性熒光探針、rs12041331號SNP位點的特異性引物及特異性熒光探針、Taq?DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水。本發明專利技術克服了過去基因突變檢測的諸多方法中各自存在的缺陷。本發明專利技術檢測準確性高、檢測簡單方便、檢測時間短、結果分析簡單的優點，能夠對PEAR1基因rs2768759號和rs12041331號兩個多態性位點進行定性檢測，根據SNP位點進行PCR熒光擴增反應，只需根據兩種不同的熒光曲線是否起線就能進行結果判斷，不會產生人為誤差，提高效率降低檢測成本，無需DNA提取，將細胞裂解后的懸液加入反應體系即可完成擴增。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物醫學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術，特別涉及一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒及其應用。
技術介紹
血小板內皮聚集受體1(PEAR1)，一種新發現跨膜蛋白，參與了誘導血小板接觸性激活過程。膠原作用于血小板之后，PEAR1胞質內酷氨酸及絲氨酸殘基磷酸化，從而使相互接觸的血小板形成更稱穩定的血栓。PEAR1可以同時調節CRP-XL和二磷酸腺苷(adenosinediphosphate，ADP)形成通路，通路與PEAR1基因的rs2768759號和rs12041331兩個SNP位點相關，其基因多態性均可能影響抗血小板聚集藥物(如阿司匹林等)的抗血小板作用。通過對PEAR1基因多態性的檢測，可以更好的了解患者對抗血小板聚集藥物的治療效果。在本專利技術作出之前，目前進行基因突變檢測的方法有數十種。金標準法為基因測序法。基因測序法是目前應用最廣泛、較準確的一種方法，但是該方法需要昂貴的儀器設備和專業的人員進行操作，費時費力，在臨床上很難進行推廣。基因芯片法具有快速高通量的優點，但是操作上復雜，步驟多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段長度多態性(RFLP)檢測基因突變的方法具有成本低廉的優點，但是過程煩瑣，時間長也不適合普及。
技術實現思路
本專利技術的目的就在于克服上述缺陷，研制一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒及其應用。本專利技術的技術方案是：一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內的物質，其主要技術特征在于：所述盒體內的物質包括檢測PEAR1基因上的rs2768759號位點的特異性引物及特異性熒光探針、rs12041331號SNP位點的特異性引物及特異性熒光探針、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水；所述PEAR1基因上的rs2768759號位點特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：正義引物：5’-CCACCCTCAGCCCTATCACT-3’，反義引物：5’-AGATTGAATCATGGGAGTGGG-3’；所述PEAR1基因上的rs12041331號位點特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：野生型探針：5’-FAM-CACCTGTCCAGTTCC-MGB-3’突變型探針：5’-HEX-CACCTGTCCCGTTCC-MGB-3’；所述PEAR1基因上的rs12041331號位點特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：正義引物：5’-GGTGAGGGGTTATCCTATGCTAC-3’，反義引物：5’-GATTAGAGTTCCTGGTGGACAAGA-3’；所述PEAR1基因上的rs2768759號位點特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：野生型探針：5’-FAM-TCTCACTTCCATCACC-MGB-3’突變型探針：5’-HEX-TCTCACTTCCGTCACC-MGB-3’。所述盒體中各物質的含量為：濃度為10μM的特異性引物共0.45μl，其中正義引物和反義引物各0.225μl；濃度為5μM的特異性熒光探針共0.2μl，其中野生型探針和突變型探針各0.1μl；濃度為5單位/μl的TaqDNA聚合酶0.02μl；濃度為20mM的dNTP混合液0.1μl；濃度為25mM的MgCl2溶液0.5μl；5X熒光定量PCR反應緩沖液2μl；去離子水4.73μl。所述檢測rs2768759號位點特異性引物中，正義引物的Tm值為58.4℃，反義引物的Tm值為58.3℃；所述特異性熒光探針中，野生型探針的Tm值為69℃，突變型探針的Tm值為68℃；所述檢測rs12041331號位點特異性引物中，正義引物的Tm值為58.7℃，反義引物的Tm值為59.1℃；所述特異性熒光探針中，野生型探針的Tm值為66℃，突變型探針的Tm值為66℃。所述試劑盒的保存溫度為-20℃。本專利技術另一技術方案是：一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒的應用，其物征在于：所述試劑盒用于檢測PEAR1基因上rs2768759號和rs12041331號SNP位點的基因型。本專利技術與現有技術相比，優點在于檢測準確性高、檢測簡單方便、檢測時間短、結果分析簡單的優點，適合臨床實驗室使用：(1)利用本專利技術試劑盒能夠對PEAR1基因rs2768759號和rs12041331號兩個多態性位點進行定性檢測，根據SNP位點進行PCR熒光擴增反應，只需根據兩種不同的熒光曲線是否起線就能進行結果判斷，不會產生人為誤差，假陽性和假陰性率低，提高效率降低檢測成本。(2)無需DNA提取，只需裂解全血細胞，將細胞裂解后的懸液加入反應體系即可完成擴增，免去DNA提取的步驟和成本并避免氣溶膠污染，提高檢測效率和準確度，縮短檢測時間。(3)本專利技術試劑盒所使用的熒光檢測探針為Taqman探針，該探針費用低廉；同時本專利技術所有的反應全程閉管操作，PGR反應后不需要進行PCR產物純化、電泳、酶切、雜交等，在節省了檢測成本的同時，大大縮短了檢測周期，提高了檢測的效率，另外降低了PCR產物污染引起假陽性的風險。附圖說明圖1——PEAR1基因上rs2768759號SNP位點純合野生型擴增曲線示意圖。圖2——PEAR1基因上rs2768759號SNP位點雜合型擴增曲線示意圖。圖3——PEAR1基因上rs2768759號SNP位點純合突變型擴增曲線示意圖。圖4——PEAR1基因上rs12041331號SNP位點純合野生型擴增曲線示意圖。圖5——PEAR1基因上rs12041331號SNP位點雜合型擴增曲線示意圖。圖6——PEAR1基因上rs12041331號SNP位點純合突變型擴增曲線示意圖。具體實施方式下面對本專利技術的實施例作詳細說明，本實施例在以本專利技術技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本專利技術的保護范圍不限于下述的實施例。一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒，試劑盒中包括以下PEAR1基因rs2768759號和rs12041331號兩個多態性位點的擴增特異性引物1對及2條特異性熒光探針。用于檢測PEAR1基因上的rs2768759號位點特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：正義引物：5’-CCACCCTCAGCCCTATCACT-3’，反義引物：5’-AGATTGAATCATGGGAGTGGG-3’；用于檢測PEAR1基因上的rs12041331號位點特異性熒光探針包括野生型本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內的物質，其特征在于：所述盒體內的物質包括檢測PEAR1基因上的rs2768759號和rs12041331兩個SNP位點的特異性引物及特異性熒光探針、Taq?DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水；所述PEAR1基因上的rs2768759號位點特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：正義引物：5’?CCACCCTCAGCCCTATCACT?3’，反義引物：5’?AGATTGAATCATGGGAGTGGG?3’；所述PEAR1基因上的rs12041331號位點特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：野生型探針：5’?FAM?CACCTGTCCAGTTCC?MGB?3’突變型探針：5’?HEX?CACCTGTCCCGTTCC?MGB?3’；所述PEAR1基因上的rs12041331號位點特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：正義引物：5’?GGTGAGGGGTTATCCTATGCTAC?3’，反義引物：5’?GATTAGAGTTCCTGGTGGACAAGA?3’；所述PEAR1基因上的rs2768759號位點特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：野生型探針：5’?FAM?TCTCACTTCCATCACC?MGB?3’突變型探針：5’?HEX?TCTCACTTCCGTCACC?MGB?3’。...

【技術特征摘要】
1.一種檢測人類PEAR1基因多態性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內的物質，其特征在
于：所述盒體內的物質包括檢測PEAR1基因上的rs2768759號和rs12041331兩個SNP位點的
特異性引物及特異性熒光探針、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應
緩沖液和去離子水；
所述PEAR1基因上的rs2768759號位點特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：
正義引物：5’-CCACCCTCAGCCCTATCACT-3’，
反義引物：5’-AGATTGAATCATGGGAGTGGG-3’；
所述PEAR1基因上的rs12041331號位點特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探
針，它們的序列為：
野生型探針：5’-FAM-CACCTGTCCAGTTCC-MGB-3’
突變型探針：5’-HEX-CACCTGTCCCGTTCC-MGB-3’；
所述PEAR1基因上的rs12041331號位點特異性引物中的正義引物和反義引物的序列
為：
正義引物：5’-GGTGAGGGGTTATCCTATGCTAC-3’，
反義引物：5’-GATTAGAGTTCCTGGTGGACAAGA-3’；
所述PEAR1基因上的rs2768759號位點特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，
它們的序列為：
野生型探針：5’-FAM-TCTCACTTCCATCACC-MGB-3’
突變型探針：5’-HEX-TCTCACTTCCGTCACC-MGB...

【專利技術屬性】
技術研發人員：徐運，邵淵，張希根，
申請(專利權)人：南京仁天生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32