一種乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法技術

本發明專利技術涉及生物技術領域，特別涉及一種乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法。該方法包括：將乳源革蘭氏陽性菌裂解、DNA酶切后，采用脈沖場凝膠電泳技術對DNA片段進行分離，所述脈沖場凝膠電泳的初始轉換時間為1.8～2.5s，終末轉換時間為8～10s。本發明專利技術脈沖場凝膠電泳分型方法可對乳源革蘭氏陽性菌進行準確分型。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，特別涉及一種乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法。
技術介紹
脈沖場凝膠電泳(PFGE，PulsedFieldGelElectrophoresis)是一種分離大分子DNA的方法。在普通的凝膠電泳中，大的DNA分子(>10kb)移動速度接近，很難分離形成足以區分的條帶。在脈沖場凝膠電泳中，電場不斷在兩種方向(有一定夾角，而不是相反的兩個方向)變動。DNA分子帶有負電荷，會朝正極移動。相對較小的分子在電場轉換后可以較快轉變移動方向，而較大的分子在凝膠中轉向較為困難。因此小分子向前移動的速度比大分子快。脈沖場凝膠電泳可以用來分離大小從10kb到10Mb的DNA分子。現今，PFGE作為一種基因分型技術得到廣泛的應用。目前，較多關于PFGE的應用集中在致病菌基因分型以及溯源方面，而從已有的報道看出這些致病菌大多為革蘭氏陰性菌，鮮有關于PFGE在革蘭氏陽性菌應用中的報道。革蘭氏陽性菌大部分為耐熱芽孢桿菌，這些耐熱芽孢桿菌在食品尤其是乳制品生產中會造成重大損失。主要在乳制品企業生產中表現在耐受傳統的巴氏殺菌(72℃/15s)，有些甚至能耐受超高溫殺菌(UHT，140-145℃/2-5s)而存活下來，對生產加工甚至最終產品有重要影響。例如，枯草芽孢桿菌對特殊菌體進行促芽孢和微膠囊包被處理，在孢子狀態下穩定性好，能耐氧化；耐擠壓；耐高溫，能長期耐60℃高溫，在120℃溫度下能存活20分鐘。目前，適合于革蘭氏陰性菌的PFGE技術無法對革蘭氏陽性菌進行準確的基因分型，PFGE在乳源革蘭氏陽性菌研究尚未有研究。因此，開展乳源革蘭氏陽性菌PFGE研究應用一方面能為這類菌進行基因分型；另一方面能進行溯源研究，控制耐熱芽孢菌對生產加工和產品影響，減少企業損失。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術提供了一種乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法。該脈沖場凝膠電泳分型方法可對乳源革蘭氏陽性菌進行準確分型。為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案：本專利技術提供了一種乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法，包括如下步驟：將乳源革蘭氏陽性菌裂解、DNA酶切后，采用脈沖場凝膠電泳技術對DNA片段進行分離，所述脈沖場凝膠電泳的初始轉換時間為1.8～2.5s，終末轉換時間為8～10s。在本專利技術提供的一些實施例中，脈沖場凝膠電泳技術的初始轉換時間為2.2s，終末轉換時間為10s。作為優選，脈沖場凝膠電泳的梯度電壓為5～7V/cm，電泳液溫度為12～16℃，電壓角度為100°～120°，初始電流為140～170mA。在本專利技術提供的一些實施例中，脈沖場凝膠電泳技術的梯度電壓為6V/cm，電泳液溫度為14℃，電壓角度為120°，初始電流為170mA。作為優選，脈沖場凝膠電泳的運行時間為15～16h。在本專利技術提供的一些實施例中，脈沖場凝膠電泳運行時間為15h。作為優選，裂解采用的裂解液為細胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。作為優選，以mL/mg/mg計，細胞裂解液、蛋白酶K與溶菌酶的用量為5：(1～3)：(7～9)。優選地，以mL/mg/mg計，細胞裂解液、蛋白酶K與溶菌酶的用量為5：2：8。作為優選，裂解采用的裂解液與乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液的體積比為(40～60)：4，乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液的OD值為4～5。優選地，裂解采用的裂解液與乳源革蘭氏陽性菌的體積比為51：4，乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液的OD值為4～4.5。作為優選，裂解的溫度為50～55℃，時間為2～5h，轉速為50～70rpm。優選地，裂解的溫度為54℃，時間為4h，轉速為60rpm。作為優選，DNA酶切采用的限制性內切酶為XbaI內切酶。在本專利技術提供的一些實施例中，DNA酶切的溫度為37℃，時間為2～4h。作為優選，將乳源革蘭氏陽性菌裂解之前還包括初步裂解的步驟，初步裂解采用的裂解液為細胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。作為優選，以mL/mg/mg計，初步裂解中，細胞裂解液、蛋白酶K與溶菌酶的用量為1：(4～6)：(18～22)。優選地，以mL/mg/mg計，初步裂解中，細胞裂解液、蛋白酶K與溶菌酶的用量為1：5：20。作為優選，初步裂解中，裂解采用的裂解液與乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液的體積比為(4～6)：4，乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液的OD值為4～5。優選地，初步裂解中，裂解采用的裂解液與乳源革蘭氏陽性菌的體積比為5：4，乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液的OD值為4.5。作為優選，初步裂解的溫度為36～38℃，時間為30～50min。優選地，初步裂解的溫度為37℃，時間為30min。在本專利技術提供的一些實施例中，乳源革蘭氏陽性菌為枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或蠟樣芽孢桿菌中的一種或幾種。在本專利技術提供的一些實施例中，乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法包括如下步驟：1、初步裂解：向400μL乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液中加入：細胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，以體積：OD計，細胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，用量分別為400μL/(4～5)、20μL/(4～5)、80μL/(4～5)，放入37℃水浴30min。2、制膠：配置1％SeakemGold:1％SDS，微波溶解，放置在55℃水浴中待用；將制得的膠與菌液混合均勻，混合時避免氣泡產生，凝固，得到膠塊。3、裂解：混合裂解液制備：細胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，以體積：OD計，細胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，用量分別為5mL/(4～5)、20μL/(4～5)、80μL/(4～5)。膠塊裂解：將膠塊與混合裂解液混合，54℃水浴4h，轉速60rpm。4、膠塊清洗：包括DDH2O清洗、TE緩沖液清洗。5、膠塊內DNA酶切：采用XbaI內切酶對膠塊內DNA進行酶切，在37℃水浴中孵育2～4小時。6、電泳：配制1％SeaKemGold(SKG)膠、加樣、電泳；電泳條件設置：梯度電壓為6V/cm，電泳液溫度為14℃，電壓角度為120°，初始轉換時間為2.2s，終末轉換時間為10s，初始電流為170mA，運行時間為15h。7、圖像處理：電泳結束后，取出膠，染色，脫色，對電泳膠塊進行拍照。在本專利技術提供的另一些實施例中，乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法包括如下步驟：1、初步裂解：向400μL乳源革蘭氏陽性菌的菌懸液中本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，包括如下步驟：將乳源革蘭氏陽性菌裂解、DNA酶切后，采用脈沖場凝膠電泳技術對DNA片段進行分離，所述脈沖場凝膠電泳的初始轉換時間為1.8～2.5s，終末轉換時間為8～10s。

【技術特征摘要】
1.一種乳源革蘭氏陽性菌的脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，包
括如下步驟：
將乳源革蘭氏陽性菌裂解、DNA酶切后，采用脈沖場凝膠電泳技術對
DNA片段進行分離，所述脈沖場凝膠電泳的初始轉換時間為1.8～2.5s，終末
轉換時間為8～10s。
2.根據權利要求1所述的脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，所述
脈沖場凝膠電泳的梯度電壓為5～7V/cm，電泳液溫度為12～16℃，電壓角度為
100°～120°，初始電流為140～170mA。
3.根據權利要求1或2所述的脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，
所述脈沖場凝膠電泳的運行時間為15～16h。
4.根據權利要求1所述的脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，所述
裂解采用的裂解液為細胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。
5.根據權利要求4所述的脈沖場凝膠電泳分型方法，其特征在于，以
mL/mg/mg計，裂解液中所述細胞裂解液、所述蛋白酶K與所述溶菌酶的用
量為5：(1～3)...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王林林，王偉軍，何光華，儲小軍，李海龍，
申請(專利權)人：杭州貝因美母嬰營養品有限公司，
類型：發明
國別省市：浙江;33