本發明專利技術公開了ISKNV基因內含子及其在區分ISKNV活病毒與滅活病毒中的應用，屬于病毒檢測領域。所述內含子定位于傳染性脾腎壞死病毒基因組NC_003494.1的ORF003L上，長度為80bp，記名為IN?3。本發明專利技術首次公開了ISKNV的一個內含子，記名為內含子IN?3。可以利用內含子IN?3轉錄被剪切的特點，作為病毒是否滅活完全的指標，建立ISKNV滅活快速檢測巢氏RT?PCR方法，可以縮短ISKNV細胞滅活疫苗生產過程中滅活檢驗周期，提高疫苗生產效率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于病毒檢測領域，具體涉及ISKNVORF003L基因內含子及其在區分ISKNV活病毒與滅活病毒中的應用。
技術介紹
鱖(Sinipercachuatsi)是我國優質淡水魚消費和出口創匯的重要品種，因其味道鮮美，蛋白質含量高而深受廣大消費者的喜愛。然而嚴重的病害問題已成為限制鱖養殖業發展的主要瓶頸，自1997年以來，鱖暴發性傳染病對鱖養殖業帶來巨大的經濟損失。吳淑勤等人首次確認了一種截面呈六角形，直徑約150nm的大型球狀病毒顆粒為鱖暴發性傳染病的主要病原。由于該病毒主要感染鱖的脾臟和腎臟，何建國等人將其命名為傳染性脾腎壞死病毒(Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)，隸屬于虹彩病毒科腫大細胞病毒屬，其全基因組測序已完成。由于傳染性脾腎壞死病毒病發病率高、致病率高、造成經濟損失大，其防控技術研究現已成為魚病研究者重要課題之一。疫苗接種是預防魚類病毒病最經濟有效的手段，針對鱖魚傳染性脾腎壞死病毒，已有細胞滅活疫苗、重組亞單位疫苗、DNA疫苗的報道。而細胞滅活疫苗因具有制備簡便、免疫效果穩定、研發周期短等優勢而成為最具產業前景的疫苗之一。DONG等人報道了以MFF細胞系為擴增體系的ISKNV細胞培養滅活疫苗，其免疫保護率達到95％；FU等人建立了對ISKNV高敏感度的CPB細胞系，為ISKNV疫苗的制備提供了新的擴增體系；付小哲等人建立了檢測ISKNV滴度的熒光定量PCR方法，為疫苗制備中病毒的定量提供了方便；羅霞等人優化了ISKNV同步接種培養條件，為細胞滅活疫苗規模化制備打下基礎。病毒滅活檢驗是ISKNV細胞滅活疫苗制備中重要的一環，但傳統病毒滅活檢測方法是通過細胞盲傳3代、同時通過接種魚體驗證病毒是否滅活完全，整個過程約需30天的時間，這大大延長了疫苗生產周期，降低了疫苗的生產效率，因此急需建立一種ISKNV滅活快速檢驗方法。病毒在細胞增殖過程中其相關基因持續轉錄，因此可通過對病毒mRNA進行監測而檢驗病毒是否滅活。劉令九等人采用細胞培養/鏈特異性RT-PCR方法建立了甲型肝炎(HepatitisA)滅活疫苗滅活驗證方法；余芬等人采用鏈特異性RT-PCR建立了一種脊髓灰質炎病毒(poliovirus)滅活快速驗證方法；Kim等人以黃瓜綠斑花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)基因組熱敏感區為靶標建立了該病的熱滅活RT-PCR快速檢測方法；但是在RT-PCR反應中存在一個主要的問題就是無法區分產物的擴增是來源于轉錄本mRNA還是殘留基因組DNA，Nelson等人報道了一種去除病毒基因組DNA殘留的RNA作為模板進行RT-PCR檢測的方法，但要將總RNA中殘留基因組DNA完全去除是很難達到的，且會造成RNA本身的損耗，降低檢測的靈敏度。另外一種有效的方法是將包含內含子的病毒基因作為靶標設計特異性引物，通過PCR擴增片段大小來區分擴增產物模板來自基因組DNA還是mRNA。ChulHyunJoo等人以含內含子的巨細胞病毒糖蛋白B為靶標建立了一種區別活的巨細胞病毒與滅活病毒的RT-PCR方法，并應用于巨細胞病毒活性感染的診斷。Yuasa等人設計了一對跨兩個外顯子的引物通過RT-PCR監測錦鯉皰疹病毒(koiherpesvirus，KHV)mRNA來檢測復制中的病毒。目前ISKNV的基因組已經公布(NC_003494.1)，基因組全長111362bp，含有124個ORF，但是尚未有任何文章報道過發現其含有內含子。因此沒有針對內含子的病毒基因為靶標通過RT-PCR方法區分ISKNV活病毒與滅活病毒方法及試劑盒的相關報道。本專利技術從ISKNV感染CPB細胞系轉錄譜結果中篩選，首次發現ISKNV的一個內含子，位于ISKNV的基因組的ORF003L上，記名為內含子IN-3。根據只有活病毒可以轉錄，且轉錄后內含子被剪切的特點，利用內含子IN-3作為病毒是否滅活完全的指標，建立ISKNV滅活快速檢測巢氏RT-PCR方法，旨在縮短ISKNV細胞滅活疫苗生產過程中滅活檢驗周期，提高疫苗生產效率。
技術實現思路
本專利技術公開了ISKNVORF003L基因內含子及其在區分ISKNV活病毒與滅活病毒中的應用。本專利技術所采取的技術方案是：一種傳染性脾腎壞死病毒ORF003L基因內含子，其定位于傳染性脾腎壞死病毒基因組NC_003494.1的ORF003L上，長度為80bp，記名為IN-3。傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)的基因組登錄號為NC_003494.1，基因組全長111362bp，含有124個ORF。專利技術人在上述124個ORF進行分析和研究，并根據本實驗室已有的ISKNV感染CPB細胞轉錄譜結果，與基因組序列比對后篩選出的4個Unigene，即ORF001L、ORF002L、ORF003L和ORF006L，實驗結果表明，僅在ORF003L存在一個內含子，其余幾個ORF序列上均無內含子存在。優選的，傳染性脾腎壞死病毒ORF003L基因的內含子IN-3的序列如下所示：GAAAAGGCAGAGCACATCACATATTGTAAAGGCCATTATTATTGTTAATAATAATAACACACATTACTGTACACATACCT(SEQIDNO：1)。優選的，傳染性脾腎壞死病毒基因組中ORF003L的序列為：ATGTCCTGGAGTCGCACAAAGGCCTTGTTGAGTAGCTCTACACGAGCCTCGTCGCACGGGGCGTCTGCTCGTATGGGTCCGCTGGATCGGCGTAGGACGTCGTGTGTAGCCACGGTATACAGCACAATGCAATTGTGCTCCGTCACACAGCTCTTGAGGTGGCTTATGCTGGTCGTGTTCAGGCGCTCCTGCGCAAAGTCAAACAGCTGTAGTTGCCCTGGTATGCGCCACTCGTTAACAGCCACCTGCTGGACCAGGCTGCAGTCAAACCCTCTAGCAGACACAAGACTACTGAGGTTCATAGCTGTCTACAACACAGACACTGCACCACAAGTCGAGATATTCAAAACACACACACATACAGACTTAAATCACTCTTTATTGTGTGATCATAGAGGCATATTTGACACTAACAGCACATGTGGGTTGCAGGGACCTACACAATATCATGAACACCTTAGACACTTTGTTGCCTTGCCTGCACGCATTGTCTATAAGTTTGCGTGCCCAATTGCGTATGTTTGTATCACATTTGATCGCCACCATCATGTCAGGCATGAGCATGCGCACATCCACCAGGCCATCCATCAACAGCATCAGGGTATGCCGGTCGGCAAACTCCGTCAAGAACGACATGCGAAGTGCCCGTAGCACACTTTCGTAGTCTGAAAAGGCAGAGCACATCACATATTGTAAAGGCCATTATTATTGTTAATAATAATAACACACATTACTGTACACATACCTTCGGTGGGAAACAGGTTCTCCCTCTTG本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種傳染性脾腎壞死病毒ORF003L基因內含子，其定位于傳染性脾腎壞死病毒基因組NC_003494.1的ORF003L上，長度為80bp，記名為IN?3。
【技術特征摘要】
1.一種傳染性脾腎壞死病毒ORF003L基因內含子，其定位于傳染性脾腎壞死病毒基因組NC_003494.1的ORF003L上，長度為80bp，記名為IN-3。2.根據權利要求1所述的內含子，其特征在于：傳染性脾腎壞死病毒ORF003L基因的內含子IN-3的序列如下所示：GAAAAGGCAGAGCACATCACATATTGTAAAGGCCATTATTATTGTTAATAATAATAACACACATTACTGTACACATACCT。3.權利要求1-2任一項所述的內含子在區分傳染性脾腎壞死病毒ISKNV活病毒與滅活病毒中的應用。4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：提取待測樣品病毒總RNA，反轉錄得到cDNA，進行PCR擴增反應，獲得擴增產物；如果擴增產物不含有內含子，則判定待測樣品中含有ISKNV活病毒。5.一種滅活傳染性脾腎壞死病毒的檢測方法，其特征在于，包括下列步驟：提取待測傳染性脾腎壞死病毒樣品的總RNA，反轉錄得到cDNA，進行PCR擴增反應，獲得擴增產物；如果擴增產物不含有內含子，則判定待測樣品中含有ISKNV活病毒；所述內含子如權利要求1-2任一項所述。6.根據權利要求5所述的檢測...
【專利技術屬性】
技術研發人員：付小哲，李寧求，張醴溪，林強，梁紅茹，劉禮輝，黃志斌，
申請(專利權)人：中國水產科學研究院珠江水產研究所，
類型：發明
國別省市：廣東;44
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