一種海洋酯酶及其編碼基因H8與應用制造技術

本發明專利技術涉及一種海洋酯酶及其編碼基因H8與應用。海洋酯酶基因H8，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；海洋酯酶H8，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發明專利技術所述的海洋酯酶H8能在20～40℃和pH?6.0～9.0范圍內保持很高的短鏈酯類降解酶活力，為廣泛應用于工業生產中奠定了基礎。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種海洋酯酶及其編碼基因H8與應用，屬于生物技術

技術介紹
酯類水解酶(lipolyticenzymes)，包括酯酶(esterases)和脂肪酶(lipases)，廣泛存在于動物、植物和微生物中。相較于動植物來源的酯酶，微生物來源的酯酶不僅種類多、來源廣和作用高效，并且利用微生物發酵產酶具有便于工業化生產、易純化等優點，因此微生物來源的酯類水解酶應用最多。酯類水解酶能夠催化酯鍵的水解和合成。酯酶通常作用于水溶性的短鏈酯類，而脂肪酶則通常水解難溶的長鏈甘油三酯。酯類水解酶具有很好的區域選擇性和立體選擇性，能在非水相體系中發揮作用，同時不需要額外的輔因子幫助催化，且底物作用譜廣等優點，這使得酯類水解酶廣泛應用于洗滌劑、化妝品、造紙業、食品工業、農業和醫藥化學等領域。在這些工業應用中，酯類水解酶通常處于高溫、高鹽以及存在有機溶劑等不利條件中。因此，對熱穩定的、耐鹽的和/或耐有機溶劑的酯類水解酶的研究和開發逐漸成為研究熱點。一般來說，耐鹽酶的蛋白表面存在大量帶負電荷的酸性氨基酸，這些酸性氨基酸能夠與溶劑中水合離子相互結合在蛋白表面形成一個保護性的水合鹽離子網絡，從而使酶蛋白在高鹽條件下保持可溶和折疊狀態，維持正常的結構和功能。因此，耐鹽酶在需要高鹽和低水活的工業應用中發揮重要作用。根據生化性質和氨基酸序列，微生物來源的酯類水解酶主要分為8個家族，第I-VIII家族。其中，第V家族以酯酶為主，這一家族酯酶在適冷菌、中溫菌和嗜熱菌中均有報道。第V家族酯酶在結構上類似于非酯類水解酶—環氧化物水解酶、脫鹵酶和鹵過氧化物酶等，后者也具有典型的α/β水解酶折疊結構。該家族已經有多個酶蛋白被表征，但是有關這一家族耐鹽性的研究到目前為止還沒有報道。海洋是一個開放、多變、復雜的生態系統。海洋微生物不僅數量巨大，而且富含多種類群，其處于不同的溫度、壓力、鹽濃度、營養物質等環境條件下，這為獲取獨特性質的具有工業潛力的新酶提供了巨大的來源。而宏基因組技術的應用，使得從各種環境資源中獲取有工業潛力的新型酯類水解酶成為可能。
技術實現思路
本專利技術針對現有技術的不足，提供一種海洋酯酶及其編碼基因H8與應用。一種海洋酯酶基因H8，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述基因編碼的海洋酯酶H8，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。一種重組表達載體，該表達載體包含有如SEQIDNO.1所示核苷酸序列的功能片段。一種重組細胞，該宿主菌包含有上述重組表達載體或表達上述海洋酯酶H8。本專利技術海洋酯酶的基因H8來自南海深海沉積物樣品S100宏基因組文庫中大腸桿菌EPI300克隆子P43-H5的大片段質粒fosmidDNA。通過構建P43-H5克隆子中fosmid的亞克隆文庫和后期測序，確定了該克隆子fosmid上攜帶的酯酶基因H8的核酸序列。根據H8基因序列設計特異性引物，利用PCR技術從P43-H5克隆子的fosmidDNA克隆了編碼海洋酯酶H8的基因，構建了含海洋酯酶基因H8的表達載體以及含有該表達載體的大腸桿菌重組細胞。測序結果表明海洋酯酶基因H8為一個含有918個核苷酸的開放閱讀框架，該開放閱讀框架共編碼305個氨基酸。因此酯酶H8是一個含有305個氨基酸的多肽。序列分析表明，海洋酯酶H8屬于酯類水解酶第V家族。對純化的海洋酯酶H8進行性質測定。結果表明該酶對短鏈的酯類(C4-C10)表現出較強的降解活性。最適pH為10.0，且在pH6.0～9.0范圍內穩定存在。最適酶活溫度為35℃，且在20～40℃范圍內保持超過80％的活力。H8在高濃度的NaCl中具有較高的酶活性，且對高濃度的NaCl表現出很好的耐受性，是耐鹽酶。上述海洋酯酶H8在水解碳鏈長度為4～10的短鏈酯類中的應用。有益效果1、本專利技術所述的海洋酯酶H8能在20～40℃和pH6.0～9.0范圍內保持很高的短鏈酯類降解酶活力，為廣泛應用于工業生產中奠定了基礎；2、本專利技術所述的海洋酯酶H8在高鹽中保持較高的酶活力，且對高鹽表現出很好的耐受性，可以在需高鹽和低水活的工業應用中發揮作用。附圖說明圖1、以海洋酯酶H8及其同源序列以及已知的酯類水解酶第V家族序列構建的系統發生樹；圖2、通過PCR擴增克隆的編碼海洋酯酶H8的基因片段的電泳圖；其中：泳道1為擴增的DNA片段，M泳道為DNA分子量標記(marker)；圖3、在大腸桿菌中進行異源表達和純化的海洋酯酶H8電泳圖；其中：1、經過鎳柱親和層析純化后的純酯酶H8電泳圖，M、蛋白質分子量標記(marker)；圖4、海洋酯酶H8的底物特異性分析；圖5、海洋酯酶H8的酶活溫度曲線；其中：A、溫度對酶活性的影響，B、溫度對酶穩定性的影響；圖6、海洋酯酶H8的酶活pH曲線；其中：A、pH對酶活性的影響，B、pH對酶穩定性的影響；圖7、不同濃度的NaCl對海洋酯酶H8酶活性的影響曲線；其中：A、NaCl對酶活性的影響，B、NaCl對酶穩定性的影響。具體實施方式下面結合附圖和實施例對本專利技術做進一步說明，但本專利技術所保護范圍不限于此。培養基：LB液體培養基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸餾水配制。LB固體平板：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％瓊脂，蒸餾水配制。實施例1：海洋酯酶H8編碼基因序列的獲取及其序列分析菌種來源：南海深海沉積物樣品S100宏基因組文庫中大腸桿菌EPI300克隆子P43-H5。具體步驟如下：1.1亞克隆文庫的構建用OMEGA公司的BAC/PACDNA提取試劑盒按照其說明提取大腸桿菌EPI300克隆子P43-H5中的大片段質粒fosmid。然后用限制性內切酶Sau3AI(購自Fermentas公司)對提取到的fosmid進行部分消化，以獲取1,500～5,000bp的DNA片段，將其連接到經BamHI消化及經堿性磷酸酶去磷酸化處理的pUC19質粒(購自NEB公司)上。連接反應液電轉E.coliTop10感受態細胞，涂布含有100μg/ml氨芐青霉素和1％(v/v)三丁酸甘油酯(購自Sigma公司)的LB固體平板，37℃倒置培養12～16h，構建成克隆子P43-H5的fosmidDNA的亞克隆文庫。1.2酯類水解酶基因序列的確定選取固體平板上產生透明降解圈的亞克隆，提取質粒并以載體特異性引物M13F/R進行測序。用GeneMark軟件預測DNA序列上可能的開放閱讀框架。用BLASTX在NCBInr庫中對預測的開放閱讀框架進行相似性搜索，以確定克隆子P43-H5上攜帶的酯酶基因序列H8，基因H8共918bp，其中含有一個918bp的開放閱讀框架，其編碼海洋酯酶H8，起始密碼子位于1bp，終止密碼子位于916bp，共編碼305個氨基酸。獲得的海洋酯酶H8編碼基因H8的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。海洋酯酶H8的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。1.3海洋酯酶H8的序列分析GenBank中，與海洋酯酶H8最相似的序列為來源于Alcanivoraxsp.的α/β水解酶(WP_062817123.1)，序列相似性為99％。該蛋白是基于基因序列預測的，其生化性質尚未被研究。在已表征過的酯類水解酶中，與海洋酯酶H8最相似的序列為第V家族的酯酶Est本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種海洋酯酶基因H8，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

【技術特征摘要】
1.一種海洋酯酶基因H8，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.權利要求1所述海洋酯酶基因H8編碼的海洋酯酶H8，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一種重組表達載體，該表達載體包含有如SE...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳秀蘭，張祎，李平一，張玉忠，秦啟龍，蘇海楠，石梅，李春陽，
申請(專利權)人：山東大學，
類型：發明
國別省市：山東;37