判定rs4676410和rs2531875單核苷酸多態性與AS之間相關性的方法技術

本發明專利技術公開一種判定rs4676410和rs2531875單核苷酸多態性與AS之間相關性的方法，所述方法是通過非標記探針的高分辨率溶解曲線法進行AS患者進行基因分型，進而判定中國人群rs4676410和rs2531875單核苷酸多態性與AS之間的相關性。目前已經明確環境因素和基因因素在AS的發生發展中有重要的作用，因此本發明專利技術的研究結果為更深入的了解AS疾病提供了理論依據。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及基因工程領域，特別涉及一種判定rs4676410和rs2531875單核苷酸多態性與AS之間相關性的方法。
技術介紹
強直性脊柱炎(AS)是一種主要侵犯脊柱，并累及骶髂關節和周圍關節的慢性進行性炎性疾病。疾病。遺傳和環境因素共同影響AS的發生發展過程。隨著全基因組關聯分析(GWAS)的興起，現已發現一系列AS相關基因，如MHC、IL23R、ERAP1、RUNX3、IL6R、ANTXR2和CARD9等。盡管如此，AS發病機理仍不是很清楚。這些研究為更深入的了解AS這個復雜的疾病提供了理論。G蛋白偶聯受體35(GPR35)和一氧化氮合成酶2(NOS2)的基因多態性與諸多自身免疫系統疾病(如AS、銀屑病等)的發病率顯著相關。GPR35在免疫調節中有重要的作用，可調節免疫細胞如自然殺傷T(NKT)細胞等炎癥因子的分泌，在免疫系統穩態維持中扮演十分重要的角色。NOS2是可誘導型一氧化氮合酶的一種，其催化合成NO在AS的發生發展過程中有重要作用。在GRP35的SNPs中，內含子區域的rs4676410可能影響GPR35的表達，并與自身免疫病炎癥性腸病(IBD)相關。NOS2的SNPs中，內含子區域的rs2531875可能影響了NOS2基因的轉錄。這兩個基因座與AS的相關性在中國大陸人中并未有報道。在此，我們擬通過新近發展起來的非標記探針高分辨率溶解曲線法，來研究中國人群rs4676410和rs2531875單核苷酸多態性與AS發病風險的相關性。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術中的不足，提供一種方法，旨在用于判定中國人群rs4676410和rs2531875單核苷酸多態性與AS之間的相關性。為實現上述目的，本專利技術提出的判定rs4676410和rs2531875單核苷酸多態性與AS之間相關性的方法，所述方法是非標記探針的高分辨率溶解曲線法。進一步地，所述方法包括如下步驟：(1)基因分型：取外周血基因組DNA，鑒定其基因型；(2)統計學分析：單核苷酸多態性與疾病相關性分析通過AS患者與正常人群次等位基因頻率比較，以及用卡方檢驗或Fisher’s精確概率法得出的Hardy-Weinberg平衡定律結果來分析，P值小于0.05認為是有統計學意義；(3)針對GPR35和NOS2內含子區域的rs4676410和rs2531875設計非標記探針，用于鑒別三種基因型的單核苷酸多態性，所述rs4676410的擴增序列如SEQIDNO:1所示；所述rs2531875的擴增序列為如SEQIDNO:2所示。進一步地，所述步驟(1)基因分型的具體流程為：首先進行PCR，20mL體系含基因組DNA模板20ng，1′PCR緩存液(Takara，Japan)，200mMdNTPs，0.5UrTaqDNA聚合酶(Takara，Japan)，0.05mM正向引物，0.5mM反向引物。PCR反應在Bio-RadS1000PCR儀上進行(Bio-Rad，美國)；PCR擴增條件如下：94℃預變性2分鐘，繼之進行50個循環，包括94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸5min；反應結束后，轉移10mLPCR產物到HR-1專用的毛細管中，再加入1mLLCGreenPlus染料(IdahoTechnology，USA)，最后以HRMinCFX96實時熒光系統C1000ThermalCycler(Bio-Rad，美國)進行檢測；rs4676410引物序列為：正向SEQIDNO:3，反向SEQIDNO:4；rs2531875引物序列為：正向SEQIDNO:5，反向SEQIDNO:6。本專利技術所述方法是通過非標記探針的高分辨率溶解曲線法進行AS患者進行基因分型，進而判定中國人群rs4676410和rs2531875單核苷酸多態性與AS之間的相關性。目前已經明確環境因素和基因因素在AS的發生發展中有重要的作用，因此本專利技術的研究結果為更深入的了解AS疾病提供了理論依據。附圖說明為了更清楚地說明本專利技術實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本專利技術的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖示出的結構獲得其他的附圖。圖1為非標記探針高分辨率溶解曲線法分析樣本中rs4676410的基因型和測序驗證。圖2為非標記探針高分辨率溶解曲線法分析樣本中rs2531875的基因型和測序驗證。本專利技術目的的實現、功能特點及優點將結合實施例，參照附圖做進一步說明。具體實施方式下面詳細描述本專利技術的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本專利技術，而不能理解為對本專利技術的限制，基于本專利技術中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本專利技術保護的范圍。實施例1、研究對象我們在北京大學深圳醫院以及一些深圳地區合作醫院收集根據美國風濕病學會(ACR)標準確診的848例AS病人(男：660例，女：188例；年齡中位數為27歲；年齡跨度在11–57歲之間)和1123例正常人(男：645例，女：478例；年齡中位數為28歲；年齡跨度在15–59歲之間)。所有正常人均無AS家族史或患其他AS相關的疾病。本研究獲得北京大學深圳醫院倫理委員會同意及所有參與者的知情同意。2、基因分型采用Innogent的全基因組DNA提取試劑盒(Innogent，China)，根據試劑盒說明書要求提取所收集的外周血基因組DNA。采用非標記探針高分辨率溶解曲線的方法鑒定樣本的基因型。方法簡述如下：首先進行PCR，20mL體系含基因組DNA模板20ng，1′PCR緩存液(Takara，Japan)，200mMdNTPs，0.5UrTaqDNA聚合酶(Takara，Japan)，0.05mM正向引物，0.5mM反向引物。PCR反應在Bio-RadS1000PCR儀上進行(Bio-Rad，美國)。PCR擴增條件如下：94℃預變性2分鐘，繼之進行50個循環，包括94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸5min。反應結束后，轉移10mLPCR產物到HR-1專用的毛細管中，再加入1mLLCGreenPlus染料(IdahoTechnology，USA)后，最后以HRMinCFX96實時熒光系統C1000ThermalCycler(Bio-Rad，美國)進行檢測。rs4676410引物序列為：正向SEQIDNO:3，反向SEQIDNO:4；rs2531875引物序列為：正向SEQIDNO:5，反向SEQIDNO:6。3、統計學分析SNP與疾病相關性分析通過AS患者于正常人群次等位基因頻率(MAF)比較，以及用卡方檢驗或Fisher’s精確概率法得出的Hardy-Weinberg平衡定律結果來分析。相關性程度以讓步比(OR)的95％置信區間(95％CI)表示。連鎖不平衡及單倍型分析均在SHEsis軟件上完成。P值小于0.05認為是有統計學意義。4、結果高分辨率溶解曲線是近年來發展起來本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種判定rs4676410和rs2531875單核苷酸多態性與AS之間相關性的方法，其特征在于，所述方法是非標記探針的高分辨率溶解曲線法。

【技術特征摘要】
1.一種判定rs4676410和rs2531875單核苷酸多態性與AS之間相關性的方法，其特征在于，所述方法是非標記探針的高分辨率溶解曲線法。2.如權利要求1所述的判定rs4676410和rs2531875單核苷酸多態性與AS之間相關性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：(1)基因分型：取外周血基因組DNA，鑒定其基因型；(2)統計學分析：單核苷酸多態性與疾病相關性分析通過AS患者與正常人群次等位基因頻率比較，以及用卡方檢驗或Fisher’s精確概率法得出的Hardy-Weinberg平衡定律結果來分析，P值小于0.05認為是有統計學意義；(3)針對GPR35和NOS2內含子區域的rs4676410和rs2531875設計非標記探針，用于鑒別三種基因型的單核苷酸多態性，所述rs4676410的擴增序列如SEQIDNO:1所示；所述rs2531875的擴增序列為如SEQIDNO:2所示。3.如權利要求2所述的判定rs4676410和rs2531875單核苷酸多態性與AS之間相關性的方...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王慶文，方征宇，韋偉，曾杏珍，楊旸，李粉玲，劉雅菁，李玉霞，蔡月明，
申請(專利權)人：北京大學深圳醫院，
類型：發明
國別省市：廣東;44