人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法技術

本發明專利技術公開一種人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參二醇皂苷元和參三醇皂苷元的制備方法。以人參為原料，提取人參二醇類皂苷（混合物）、人參三醇類皂苷（混合物）和人參自身皂苷酶復合物。人參二醇類皂苷和三醇類皂苷，分別與有機溶劑及緩沖液配制成底物溶液，分別與曲霉菌微生物發酵得到的粗酶液反應，幾乎沒有其他副產物皂苷，分別得到人參稀有皂苷C-K或人參稀有皂苷F1；反應后酶可回收、重復使用。所得到的C-K或F1皂苷與人參自身皂苷酶復合物分別反應（適當加入有機酸），分別得到四種異構體人參二醇皂苷元和人參三醇皂苷元。操作簡單、收率高，成本低，適合大批量生產；所得產品可用于藥物開發、人參制品、保健品和化妝品。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種人參稀有皂苷和四種異構體人參皂苷元的制備方法，尤其是一種操作簡單、成本低、得率及純度高、適合大批量生產的人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法。
技術介紹
我國目前產量高的人參主要為人參（PanaxginsengC.A.Mayer）、西洋參（P.quinguefolusL.）和三七參（P.notoginsengburk）。人參根的主要皂苷為Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1；西洋參的主要皂苷以Rb1和Re為主，還含Rb2、Rc、Rd、Rg1皂苷；三七參的主要皂苷以Rb1和Rg1為主，還含Rd、Re、R1皂苷；其他皂苷含量較低。人參主要原人參二醇類（PPD）皂苷結構如下：注：Glc,β-D-吡喃葡萄糖基；Arap,α-L-吡喃阿拉伯糖基；Araf,α-L-呋喃阿拉伯糖基；Xyl，β-D-吡喃木糖基。紅參中存在四種異構體的人參二醇皂苷元和人參三醇皂苷元（文獻：LarsP.Christensened.Ginsenosides:Chemistry,Biosynthesis,Analysis,andPotentialHealthEffects.AdvancesinFoodandNutritionResearch.(2009)Volume55,p.1-99.ElsevierInc.）。紅參中存在的四種異構體的人參二醇皂苷元為20(S)-人參二醇皂苷元[20(S)-PPDol]，20(R)-人參二醇皂苷元[20(R)-PPDol]，20-羥基脫的20(21),24-二烯人參二醇皂苷元[PPDol(-H2O)-20(21),24-diene]，20-羥基脫水的20(22),24-二烯人參二醇皂苷元[PPDol(-H2O)-20(22),24-diene]；人參稀有皂苷C-K和四種異構體的人參二醇皂苷元結構如下：人參主要原人參三醇類（PPT）皂苷結構如下：注：Glc,β-D-吡喃葡萄糖基；Rha，α-L-吡喃鼠李糖基；Xyl，β-D-吡喃木糖基。紅參中存在的四種異構體的人參三醇皂苷元為20(S)-人參三醇皂苷元[20(S)-PPTol]，20(R)-人參三醇皂苷元[20(R)-PPTol]，20-羥基脫水人參三醇皂苷元-20(21),24-二烯[PPTol(-H2O)-20(21),24-diene]，20-羥基脫水人參三醇皂苷元-20(22),24-二烯[PPTol(-H2O)-20(22),24-diene]。上述人參皂苷元異構體，紅參中極其微量存在。人參稀有皂苷F1和四種異構體的人參三醇皂苷元結構如下：四種異構體的人參二醇皂苷元和四種異構體的人參三醇皂苷元的生理活性遠高于人參皂苷。人參口服后在腸道菌的作用下人參二醇類皂苷（Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd）轉化為C-K，人參三醇類皂苷（Re、Rg1）轉化為F1，繼而被吸收、起藥效；因此，人參皂苷C-K和F1是吸收率高、生理活性高的人參稀有皂苷（文獻：MKanaoke,TOkao,KKobashi.JTradMed.199411,241-245）。因此，大量制備高活性人參稀有皂苷C-K和F1、四種異構體的人參二醇皂苷元和人參三醇皂苷元，對人參制品、保鍵食品和化妝品以及藥物開發意義很大。為了得到高活性、容易吸收的的人參稀有皂苷，國際專利申請PCT/CN00/00744（中國ZL0082112.9、歐洲EP1354944、美國專利技術專利US7,759,101B2、日本JP-4953547；文獻2）等，公開了從人參中含量高的Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1酶轉化制備Rh2、Rg3、C-K、Rg2和Rh1等；所公開的人參皂苷酶來自細菌、霉菌、酵母菌、麥芽、人參植物、動物肝，按照水解皂苷糖基位置不同，分為四種人參皂苷酶：人參皂苷酶I型，能水解人參二醇皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc等的3-O-（第三碳）糖基和20-O-糖基，逐步得到Rd→F2→C-K（或Rh2）等皂苷；人參皂苷酶II型，能水解人參二醇皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc等20-O-糖基，逐步生成Rd和Rg3；人參皂苷酶III型，能水解人參皂苷Rd的3-O-糖基，生成C-K；人參皂苷酶IV型，能水解人參皂苷Re和Rg2的6-O-糖基，生成Rg1和Rh1。如上所述可利用人參皂苷酶III型轉化Rd單體皂苷制備C-K，但是Rd單體和人參皂苷酶III純酶成本太高，產業化難度大；其他二醇皂苷酶反應，雖然產生C-K皂苷，但反應物有很多其他皂苷副產物，不僅C-K轉化率低，而且還增加了產物中分離C-K的步驟，操作麻煩。論文（J.Microbiol.Biotechnol.2011,21(10),1057–1063）報道，來自米曲霉的人參皂苷酶IV水解Re和R1皂苷的6-O-鼠李糖和木糖基變成Rg1，進一步水解Rg1的6-O-葡萄糖基變成F1皂苷，Rg2轉化為Rh1和20(S)-人參三醇苷元。論文（J.Microbiol.Biotechnol.2012;22,343~351；論文PLOSONE，2014，(9),1-16,e96914(PosOne:June2014/Volume9/Issue6/e96914，文獻5)報道，很多新發現的微生物的酶、轉基因克隆得到的人參皂苷酶，能水解人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1的生成相應的低糖基稀有皂苷F2、C-K、F1、20(S)-Rg2、20(S)-Rg3、20(S)-Rh1、20(S)-Rh2；但是這些酶反應產生很多副產物。日本小橋等（文獻：MKanaoke,TOkao,KKobashi.JTradMed.199411,241-245）報道，人參口服后在腸道菌的作用下人參二醇類皂苷Rb1等逐漸轉化為Rd，F2，C-K、20(S)-二醇皂苷元；人參三醇類皂苷Re等逐漸轉化為Rg1、F1、20(S)-三醇皂苷元被吸收，但其轉化微弱。因此，現有技術所公開的酶轉化法水解人參二醇類皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd制備C-K皂苷或酶轉化法水解人參三醇類皂苷Re、R1、Rg1制備F1皂苷，均存在著副產物多，稀有皂苷C-K或F1轉化率低等缺點，且需要從眾多副產物中分離提純，操作麻煩、難度大；而且上述酶反應只能微量地生成20(S)-人參二醇皂苷元和20(S)-人參三醇皂苷元，無法生產四種異構體的皂苷元。
技術實現思路
本專利技術是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種操作簡單、成本低、得率及純度高、適合大批量生產的人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種人參稀有皂苷C?K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法，其特征在于按照如下步驟進行：a.?以人參為原料，分離提取人參二醇類皂苷混合物、人參三醇類皂苷混合物；b.?分別以人參二醇類皂苷混合物或人參三醇類皂苷混合物為原料，與有機溶劑及緩沖液配制成底物溶液，再將底物溶液與曲霉菌微生物發酵得到的粗酶液反應；c.?分別提取反應液中皂苷，得到人參稀有皂苷C?K或人參稀有皂苷F1。

【技術特征摘要】
1.一種人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法，其特
征在于按照如下步驟進行：
a.以人參為原料，分離提取人參二醇類皂苷混合物、人參三醇類皂苷混合物；
b.分別以人參二醇類皂苷混合物或人參三醇類皂苷混合物為原料，與有機溶劑及緩
沖液配制成底物溶液，再將底物溶液與曲霉菌微生物發酵得到的粗酶液反應；
c.分別提取反應液中皂苷，得到人參稀有皂苷C-K或人參稀有皂苷F1。
2.根據權利要求1所述人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法，其
特征在于所述底物溶液中緩沖液的pH為4.5～6.0，濃度為0.01～0.05M，有機溶劑的質量濃
度為5～40%，人參二醇類皂苷混合物或人參三醇類皂苷混合物的質量濃度為0.5～8%；所述
緩沖液為醋酸緩沖液、檸檬酸緩沖液或磷酸緩沖液，所述有機溶劑為丙醇、丙酮、乙醇或甲
醇。
3.根據權利要求2所述人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法，其
特征在于所述粗酶液是采用黑曲霉菌或者米曲霉菌液態發酵或者固態發酵，酶發酵培養基
的產酶誘導物是人參粉、人參總皂苷或槐花粉；對發酵酶液或者固態發酵酶提取液離心除
渣，收集酶蛋白沉淀，將酶蛋白沉淀溶解于緩沖液中即可。
4.根據權利要求3所述人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備方法，其
特征在于所述底物溶液與粗酶液反應是將底物溶液與粗酶液混合，在35～60℃反應16～48
小時；所述底物溶液與粗酶液的體積比為1：0.1~1。
5.根據權利要求1、2、3或4所述人參稀有皂苷C-K、F1及四種異構體人參皂苷元的制備
方法，其特征在于所述c步驟提取反應液中皂苷如下：加入反應液2～4倍體積的有機溶劑沉
淀酶蛋白，得上清液，經脫色大孔樹脂柱脫色、減壓濃縮及回收有機溶劑得濃縮液，再將所...

【專利技術屬性】
技術研發人員：魚紅閃，劉春瑩，金鳳燮，
申請(專利權)人：金鳳燮，
類型：發明
國別省市：遼寧;21