預測三種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法技術

本發明專利技術公開了預測三種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法，為克服現有毒理學急性聯合毒性評價技術試驗工作量大、定量評價與急性聯合毒性作用預測方法缺失的問題，預測三種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法：1)預試驗即確定正式試驗中各農藥的試驗濃度：預試驗即確定正式試驗中各農藥的試驗濃度的步驟如下：(1)初步確定單一農藥的高、中、低發光菌毒性濃度范圍；(2)建立單一農藥的劑量?效應方程y＝f(x)(x∈[C，C′])；(3)確定BBD試驗中各農藥的試驗濃度。2)采用三因素三水平中心組合試驗設計(BBD)確定試驗方案；3)正式試驗即測定各試驗組發光菌相對發光抑制率；4)建立模型預測三種農藥對發光菌的急性聯合毒性。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及化合物急性生物毒性的一種預測方法，更確切地說，本專利技術涉及一種預測三種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法。
技術介紹
發光菌毒性測試是20世紀70年代后興起的一種微生物檢測環境污染及檢測物毒性的有效方法。采用現代光電檢測手段的發光菌生物毒性試驗是現代毒理學研究中主要的生物毒性測定方法之一。國際標準組織(ISO)、美國和中國等均頒布了發光菌用于評估水質毒性的相關標準。環境中存在的污染物種類繁多,化合物聯合毒性作用一直以來受到人們廣泛關注。目前，污染物聯合毒性評價以定性評價方法為主,其中毒性單位法(TU)和相加指數法應用最多。這些定性方法都是以評價多種化合物共同存在時，對生物的聯合作用屬于相加作用、獨立作用、協同作用、拮抗作用為最終目標。受到化合物聯合毒性定量預測方法不足的限制，目前的聯合毒性評價方法很難實現定量評價。響應曲面法(Responsesurfacemethodology，RSM)作為一種優化生物過程的統計分析方法，在化合物聯合毒性實現定量預測，評價化合物聯合毒性具有重要作用。但其應用受到需要采集大量試驗數據進行復雜的非線性擬合的限制。目前有針對三種重金屬，每種重金屬分別設定2個濃度，采用交叉分組的試驗設計(即兩水平析因試驗)，采用響應曲面分析法建模、預測和評價重金屬聯合毒性的報道，但其對重金屬聯合毒性預測的范圍僅為發光菌相對發光抑制率10％至80％，且對于農藥聯合毒性評價是否適用，尚未有定論。中心組合試驗設計(Box-BehnkenDesign，簡稱BBD)通常作為確定多因素系統中最佳條件的數學統計方法，用于生產條件或生產工藝的優化。應用BBD方法設計試驗方案，采用響應曲面法建立模型，具有試驗工作量小、可建立影響因素與評價指標間的量化模型、可預測發光菌相對發光抑制率在0％至100％范圍內的3種農藥急性聯合毒性。目前BBD試驗設計方法未有用于評價化合物發光菌急性聯合生物毒性評價的報道。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是克服現有毒理學急性聯合毒性評價技術試驗工作量大、定量評價與急性聯合毒性作用預測方法缺失的問題，提供一種預測3種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法。為解決上述技術問題，本專利技術是采用如下技術方案實現的：所述的預測三種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法的步驟如下：1.預試驗即確定正式試驗中各農藥的試驗濃度；2.采用三因素三水平中心組合試驗設計BBD確定試驗方案；3.正式試驗即測定各試驗組的發光菌相對發光抑制率；4.建立模型預測三種農藥對發光菌的急性聯合毒性。技術方案中所述的預試驗即確定正式試驗中各農藥的試驗濃度的步驟如下：1)初步確定單一農藥的高、中、低發光菌毒性濃度范圍；2)建立單一農藥的劑量-效應方程y＝f(x)(x∈[C，C′])；3)確定BBD試驗中各農藥的試驗濃度。技術方案中所述的初步確定單一農藥的高、中、低發光菌毒性濃度范圍是指：(1)按照農藥的化學性質，分別針對甲、乙、丙三種農藥，初步設定高、中、低3個濃度，每個濃度取2ml加入具塞磨口比色管，加入復蘇后的菌液15ul，蓋上蓋子上下顛倒數次使其充分混勻；(2)去塞，靜置反應15min后，置入毒性測試儀樣品艙內，讀出發光量；(3)每個濃度做三次重復實驗，并以2ml濃度為3g/100ml的氯化鈉為對照，通過公式1計算發光菌相對發光抑制率：式中：對照發光強度指3g/100ml的氯化鈉在毒性測試儀中顯示的發光量，單位為cd；樣品發光強度指每個樣品在毒性測試儀中顯示的發光量,單位為cd；(4)通過試驗并計算不同濃度下發光菌的相對發光抑制率，若3個濃度中存在使發光菌相對發光抑制率接近100％的農藥濃度C′和使發光菌發光抑制率接近0％的農藥濃度C，則進行下一步驟；若未確定C′和C，根據試驗結果，放大或縮小高、中、低濃度的范圍，重新設定高、中、低3個濃度，重復步驟(1)至步驟(3)，直至確定所需農藥濃度。技術方案中所述的建立單一農藥的劑量-效應方程y＝f(x)(x∈[C，C′])是指：(1)在單個農藥發光菌相對發光抑制率接近0％的農藥濃度C和發光菌相對發光抑制率接近100％的農藥濃度C′的濃度范圍內，按照等差或等比關系，設置5個濃度梯度，其中包括C和C′，針對這5個濃度，按照初步確定單一農藥的高、中、低發光菌毒性濃度范圍的步驟描述的方法，繼續開展發光菌試驗；(2)試驗結束后，建立單個農藥的劑量-效應方程y＝f(x)(y∈[0％，100％])：以試驗濃度作為橫坐標(x)，對發光菌相對發光抑制率作為縱坐標(y)，按照毒理學中化合物發光菌劑量-效應的一般規律，所建立的劑量-效應方程通常可為三種形式：y＝a+d(x)方程1y＝b-glg(x)方程2y＝c-h/lg(x)方程3式中：a、b、c分別代表不同方程各自的常數項，均為實數；d、g、h分別代表不同方程各自的自變量系數，均為實數；(3)選取方程1至方程3中發光菌相對發光抑制率計算值與實際測定值相關性最高的一個作為單一農藥的劑量-效應方程。技術方案中所述的確定BBD試驗中各農藥的試驗濃度是指：利用各農藥已確定的劑量-效應方程，求出農藥對應發光菌相對發光抑制率為50％時的濃度值C0，作為中心組合試驗設計中的0水平；對于每種農藥，-1和1水平對應濃度的設置，參照以下三個原則：(1)-1，0和1水平分別對應C-1,C0,C1濃度值，C-1與C0、C0與C1之間均符合等差濃度關系；(2)-1和1水平濃度值對應的發光菌相對發光抑制率分別最接近0％和100％；(3)為保證生物學意義，1水平對應的C1濃度值不可超過C′即相對發光抑制率100％的濃度值；以上-1，0和1為編碼值，用于試驗方案的設計、分析與初步建模。技術方案中所述的采用三因素三水平中心組合試驗設計BBD確定試驗方案是指：按照BBD方法進行三因素三水平的試驗設計，編碼值為0的中心點設置5次重復實驗，共17組試驗；其中，各因素及其不同水平的設置如表1所示，試驗方案如表2所示；表1三因素三水平的設置表2試驗方案(以編碼值表示)技術方案中所述的正式試驗即測定各試驗組的發光菌發光抑制率是指：(1)按照表2的試驗設計方案，將三種農藥按照表2所示的17個不同試驗組中編碼值所對應的濃度混勻；(2)取每個試驗組的混合農藥2ml加入具塞磨口比色管，加入復蘇后的菌液15ul，蓋上蓋子上下顛倒數次使其充分混勻；(3)去塞，靜置；(4)反應15min后，置入毒性測試儀的樣品艙內，讀出發光量。(5)每個濃度做三次重復實驗，并以2ml濃度為3g/100ml的氯化鈉為對照,發光菌相對發光抑制率采用“公式1”即計算；公式中：對照發光強度指3g/100ml的氯化鈉在毒性測試儀中顯示的發光量，單位為cd；樣品發光強度指每個樣品在毒性測試儀中顯示的發光量,單位為cd。技術方案中所述的建立模型預測三種農藥對發光菌的急性聯合毒性是指：1)應用DesignExpert軟件,點擊反應曲面菜單；2)在響應曲面菜單中選擇中心組合試驗進行試驗的設計，進入到中心組合試驗設計頁面；3)數字因素輸入“3”，定性因素輸入“0”，每塊的中心點輸入“5”，生成與本試驗方案一致的表格；4)在表格中，將試驗測定的各組發光菌的相對發光抑制率作為Y值，輸入到不同試驗組的對應R1位置，以便進入下一本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種預測三種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法，其特征在于，所述的預測三種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法的步驟如下：1)預試驗即確定正式試驗中各農藥的試驗濃度；2)采用三因素三水平中心組合試驗設計BBD確定試驗方案；3)正式試驗即測定各試驗組的發光菌相對發光抑制率；4)建立模型預測三種農藥對發光菌的急性聯合毒性。

【技術特征摘要】
1.一種預測三種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法，其特征在于，所述的預測三種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法的步驟如下：1)預試驗即確定正式試驗中各農藥的試驗濃度；2)采用三因素三水平中心組合試驗設計BBD確定試驗方案；3)正式試驗即測定各試驗組的發光菌相對發光抑制率；4)建立模型預測三種農藥對發光菌的急性聯合毒性。2.按照權利要求1所述的預測三種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法，其特征在于，所述的預試驗即確定正式試驗中各農藥的試驗濃度的步驟如下：1)初步確定單一農藥的高、中、低發光菌毒性濃度范圍；2)建立單一農藥的劑量-效應方程y＝f(x)(x∈[C，C′])；3)確定BBD試驗中各農藥的試驗濃度。3.按照權利要求2所述的預測三種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法，其特征在于，所述的初步確定單一農藥的高、中、低發光菌毒性濃度范圍是指：(1)按照農藥的化學性質，分別針對甲、乙、丙三種農藥，初步設定高、中、低3個濃度，每個濃度取2ml加入具塞磨口比色管，加入復蘇后的菌液15ul，蓋上蓋子上下顛倒數次使其充分混勻；(2)去塞，靜置反應15min后，置入毒性測試儀樣品艙內，讀出發光量；(3)每個濃度做三次重復實驗，并以2ml濃度為3g/100ml的氯化鈉為對照，通過公式1計算發光菌相對發光抑制率：式中：對照發光強度指3g/100ml的氯化鈉在毒性測試儀中顯示的發光量，單位為cd；樣品發光強度指每個樣品在毒性測試儀中顯示的發光量,單位為cd；(4)通過試驗并計算不同濃度下發光菌的相對發光抑制率，若3個濃度中存在使發光菌相對發光抑制率接近100％的農藥濃度C′和使發光菌發光抑制率接近0％的農藥濃度C，則進行下一步驟；若未確定C′和C，根據試驗結果，放大或縮小高、中、低濃度的范圍，重新設定高、中、低3個濃度，重復步驟(1)至步驟(3)，直至確定所需農藥濃度。4.按照權利要求2所述的預測三種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法，其特征在于，所述的建立單一農藥的劑量-效應方程y＝f(x)(x∈[C，C′])是指：(1)在單個農藥發光菌相對發光抑制率接近0％的農藥濃度C和發光菌相對發光抑制率接近100％的農藥濃度C′的濃度范圍內，按照等差或等比關系，設置5個濃度梯度，其中包括C和C′，針對這5個濃度，按照初步確定單一農藥的高、中、低發光菌毒性濃度范圍的步驟描述的方法，繼續開展發光菌試驗；(2)試驗結束后，建立單個農藥的劑量-效應方程y＝f(x)(y∈[0％，100％])：以試驗濃度作為橫坐標(x)，對發光菌相對發光抑制率作為縱坐標(y)，按照毒理學中化合物發光菌劑量-效應的一般規律，所建立的劑量-效應方程通常可為三種形式：y＝a+d(x)方程1y＝b-glg(x)方程2y＝c-h/lg(x)方程3式中：a、b、c分別代表不同方程各自的常數項，均為實數；d、g、h分別代表不同方程各自的自變量系數，均為實數；(3)選取方程1至方程3中發光菌相對發光抑制率計算值與實際測定值相關性最高的一個作為單一農藥的劑量-效應方程。5.按照權利要求2所述的預測三種農藥對發光菌急性聯合毒性的方法，其特征在于，所述的確定BBD試驗中各農藥的試驗濃度是指：利用各農藥已確定的劑量-效應方程，求出農藥對應發光菌相對發光抑制率為50％時的濃度值C0，作為中心組合試驗設計中的0水平；對于每種農藥，-1和1水平對應濃度的設置，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張蕾，戚飛飛，高燕，劉晗，于海業，張剛，付強，付海明，
申請(專利權)人：吉林大學，
類型：發明
國別省市：吉林;22