本發明專利技術提供一種短鏈脫氫酶，及其基因，重組短鏈脫氫酶，含有該基因的重組表達載體，和基因工程菌，該重組酶的制備方法，以及該短鏈脫氫酶或含有該酶的基因工程菌在不對稱還原潛手性酮合成蝦青素手性中間體中的應用。本發明專利技術中所述短鏈脫氫酶不對稱還原制備手性醇具有顯著優點，能夠合成高光學純度蝦青素手性中間體(ee>99％)。催化劑易于制備、反應條件溫和、底物適應性廣、環境友好，且其重組細胞能夠在不外加任何輔酶的含異丙醇反應體系中高效催化潛手性酮的不對稱還原，具有很好的工業化應用開發前景。
【技術實現步驟摘要】
(一)
本專利技術屬于生物化工
，具體涉及一種短鏈脫氫酶及其基因，以及含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，以及該短鏈脫氫酶或含有該酶的重組細胞在蝦青素手性中間體合成中的應用。(二)
技術介紹
蝦青素(Astaxanthin，3,3’-二羥基-4,4’-二酮基-β,β’-胡蘿卜素)是自然界廣泛存在的一種新型類胡蘿卜素。蝦青素是世界上最強的天然抗氧化劑之一，其抗氧化能力是其它類胡蘿卜素的10倍以上，是維生素E的300～500倍；具有抗腫瘤、抗輻射、抗衰老、提高免疫力、抗光敏作用及機體顯色等多種生物學功能，因此，被廣泛應用于保健品、藥品、化妝品、食品及飼料等的生產中。蝦青素主要有三種不同的異構體型態，而抗氧化活性最強的是(3S,3’S)-構型的蝦青素。目前，蝦青素主要獲取方法包括化學合成、從甲殼綱動物的殼中提取和微生物發酵等。其中，化學合成的蝦青素于上世紀80年代被美國FDA批準用于水產飼料添加劑；但是化學合成蝦青素多種異構體的同時存在，不利于動物的消化吸收和體內沉積；此外，人們對化學合成蝦青素食用安全性的疑慮一直未消除，對它的使用也僅限于飼料添加劑行業。相對于化學合成的蝦青素，天然蝦青素具有生產過程較為簡單、產品中很少有非功能性異構體、功能豐富、容易被吸收和抗氧化活性強等優點，因此，天然蝦青素的高效生產成為重要選擇。然而，由于甲殼動物的甲殼中含有較高的幾丁質和灰分，較低濃度的蛋白質和其他營養成分，限制了甲殼動物蝦青素的提取和再利用。另一方面，雖然可通過菌種選育、發酵條件優化等多種途徑提高微生物(紅法夫酵母和雨生紅球藻等)的蝦青素的產量，但由于對合成蝦青素的次級代謝機制研究不夠深入，蝦青素的產量一直未得到突破性的提高。生物催化法由于立體選擇性高、反應條件溫和、環境友好等優點成為最受矚目的醫藥及精細化學品綠色合成技術之一。因此，利用生物催化法高立體選擇性的合成(3S,3’S)-蝦青素的重要手性中間體，進而獲得抗氧化活性最強的手性蝦青素單體將具有重要意義。(三)
技術實現思路
本專利技術目的在于提供一種惡臭假單胞菌Pseudomonasputida短鏈脫氫酶基因及其重組短鏈脫氫酶，以及含有該基因的重組表達載體，重組表達轉化體，該重組酶的制備方法，以及該短鏈脫氫酶或含有該酶的重組細胞在(3S,3’S)-蝦青素手性中間體合成中的應用。本專利技術采用的技術方案是：本專利技術的第一方面提供一種短鏈脫氫酶，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。本專利技術的短鏈脫氫酶來源于惡臭假單胞菌ATCC12633(PseudomonasputidaATCC12633)。任何對SEQIDNO：2所示氨基酸序列中氨基酸經過缺失、插入或替換一個或幾個氨基酸且具有短鏈脫氫酶活性的，仍屬于本專利技術的保護范圍。本專利技術的第二方面提供一種短鏈脫氫酶基因，其(1)核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示；或(2)編碼氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2中所示的蛋白質。該基因是通過PCR技術從惡臭假單胞菌ATCC12633(PseudomonasputidaATCC12633)基因組中克隆獲得。具體制備方法為：根據Genbank中收錄的短鏈脫氫酶的基因序列設計合成引物，較佳的，上游引物為：GCTGAGGATCCATGGCTAATGCAAAAACCGC；下游引物為：GCATCCTCGAGTCACCAGACCAAGGGTTCGC；然后以PseudomonasputidaATCC12633基因組DNA為模板，利用聚合酶鏈式反應(PCR)進行基因擴增，獲得全長687bp的短鏈脫氫酶基因序列。該短鏈脫氫酶基因核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示。該序列編碼的蛋白質的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo：2所示。如本領域技術人員所知，本專利技術的短鏈脫氫酶基因的核苷酸序列也可以是編碼序列表中SEQIDNo：2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的其它任何核苷酸序列。任何對SEQIDNO：1所示核苷酸序列進行一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入處理獲得的核苷酸序列，只要其與核苷酸具有90％以上的同源性，均屬于本專利技術的保護范圍。本專利技術的第三方面提供一種包含本專利技術的短鏈脫氫酶基因的核苷酸序列的重組表達載體。這些重組載體可通過本領域常規方法將本專利技術的短鏈脫氫酶核苷酸序列連接于各種載體上構建而成。所述載體可為本領域常規的各種載體，如各種質粒、噬菌體或病毒載體等，優選pET-30a。較佳地，可通過下述方法獲得本專利技術的重組表達載體：將通過PCR擴增所得的短鏈脫氫酶基因產物Ppysdr與載體pET-30a連接構建本專利技術的短鏈脫氫酶基因重組表達質粒pET30a-Ppysdr。本專利技術的第四方面提供一種表達重組短鏈脫氫酶的基因工程菌，可通過將本專利技術的重組表達載體轉化至宿主微生物中獲得。所述的宿主微生物可為本領域常規的各種宿主微生物，只要滿足重組表達載體可以穩定自我復制且所攜帶的本專利技術的短鏈脫氫酶基因可以有效表達。本專利技術優選大腸桿菌，更優選大腸桿菌E.coliBL21(DE3)。將重組質粒pET30a-Ppysdr轉化至E.coliBL21(DE3)中，獲得工程菌E.coliBL21(DE3)/pET30a-Ppysdr。本專利技術的第五方面提供一種重組短鏈脫氫酶的制備方法，包括如下步驟：培養本專利技術的重組表達轉化體，誘導獲得重組短鏈脫氫酶。其中，所述的培養重組表達轉化體所用的培養基可以是本領域可使轉化體生長并產生本專利技術的短鏈脫氫酶的培養基，優選LB培養基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L，pH7.2。培養方法和培養條件沒有特殊限制，只要使轉化體能夠生長并產生短鏈脫氫酶即可。優選下述方法：將本專利技術涉及的重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pET30a-Ppysdr接種至含卡那霉素的LB培養基中培養，當培養液的光密度OD600達到0.5～0.7時，在終濃度為0.1～1.0mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導下，即可高效表達本專利技術的重組短鏈脫氫酶。本專利技術的第六方面提供所述短鏈脫氫酶或其重組細胞在不對稱催化潛手性酮(I)制備(3S,3’S)-蝦青素手性中間體(II)中的應用。具體的，所述的應用為：以潛手性酮(I)為底物，以所述短鏈脫氫酶或其重組細胞為催化劑，以NADH或NADPH為輔酶，20～50℃下，于pH5.5～10.5的緩沖液構成的轉化反應體系a中反應，反應完全后，將反應液分離純化得到相應產物。所述的反應條件可按本領域所用的常規條件進行選擇。進一步，所述轉化體系a中底物初始濃度為5～1000mmol/L。進一步，所述轉化體系a中重組短鏈脫氫酶純酶在反應液中較佳的濃度為0.1～2.0mg/mL。所述轉化體系a中菌體的質量用量以菌體濕重計為10～400g/L。進一步，所述轉化體系a還包括有機溶劑，由底物、催化劑、有機溶劑與pH5.5～10.5的緩沖液構成轉化體系b，有機溶劑占轉化體系b總體積1～20％，轉化體系b中底物初始濃度為5～1000mmol/L，菌體的質量用量以菌體濕重計為10～400g/L。進一步，所述反應在pH7.5的緩沖液中進行。進一步，反應體系還可添加1～15％醇或糖作為輔底物，可以顯著提高反應的活力。所述輔底物包括但本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種短鏈脫氫酶，其特征在于，所述短鏈脫氫酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。
【技術特征摘要】
1.一種短鏈脫氫酶，其特征在于，所述短鏈脫氫酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。2.一種編碼權利要求1所述短鏈脫氫酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示或編碼氨基酸序列SEQIDNO：2中所示蛋白質或核苷酸序列。3.如權利要求2所述的基因的制備方法，其特征在于，首先，設計引物，上游引物為：GCTGAGGATCCATGGCTAATGCAAAAACCGC，下游引物為：GCATCCTCGAGTCACCAGACCAAGGGTTCGC；然后以PseudomonasputidaATCC12633基因組DNA為模板，利用聚合酶鏈式反應進行基因擴增，獲得短鏈脫氫酶基因序列。4.一種重組表達載體，其特征在于，所述載體包含權利要求2所述的短鏈脫氫酶/還原酶基因的核苷酸序列。5.一種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由權利要求4所述的重組表達載體轉化至宿主微生物中獲得。6.一種如權利要求1所述的短鏈脫氫酶的制備方法，其特征在于，包括以...
【專利技術屬性】
技術研發人員：于洪巍，李愛朋，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：浙江;33
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