一種轉移質粒及其構建方法和重組慢病毒技術

本發明專利技術公開了一種轉移質粒，其結構如圖1所示。本發明專利技術還公開了一種轉移質粒的構建方法及重組慢病毒。該轉移質粒，其報告基因Luciferase與ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV啟動子控制報告基因Luciferase與ZsGreen的表達，使得HIV-1抑制劑的抗病毒效果能夠簡易地通過在倒置熒光顯微鏡下觀察到或通過測定熒光素酶活性而獲得，將pol區導入后，多種細胞用具有此轉移質粒的重組慢病毒均可進行耐藥性檢測。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及及醫學分子生物學領域，具體涉及了一種轉移質粒及其構建方法和重組慢病毒。
技術介紹
過去的數十年中，多種HIV-1抑制藥物已批準入市，用于HIV感染病人的治療。基于HIV-1逆轉錄酶和(或)蛋白酶的兩種或多種抑制劑聯合應用的高效抗逆轉錄病毒療法(HAART)，被公認為是治療HIV感染病人最有效方法之一。它不僅能夠提高HIV感染病人的生活質量也能降低HIV的感染風險。盡管HAART能夠抑制病毒的復制和降低HIV感染的風險，但不能清除HIV-1感染者體內的病毒。因此，抗逆轉錄病毒療法會因藥物選擇性壓力下新現的耐藥毒株而大打折扣。因此，很有必要監測耐藥毒株并對臨床精準抗病毒治療提供指導。目前，對于HIV-1藥物耐藥性檢測主要有基因型和表型耐藥兩種檢測類型。基因型耐藥檢測是通過序列分析，能檢出HIV-1靶基因中特定耐藥相關的基因突變，因其操作簡便，成本低廉，及在線的評估系統的應用，較表型耐藥檢測常用。但是，基因型檢測不能用于解釋不常見的突變或幾種突變型的混合突變。表型耐藥檢測，能夠在體外測定HIV-1抑制劑作用下的病毒產量或酶活性，能夠直接測定每種抑制劑的耐藥水平，而無需知曉HIV-1毒株的基因突變。因此，表型耐藥檢測對于HIV-1感染的病人，特別是為已經多次治療的病人提供精準的藥物指導是很有意義的。通常情況下，表型耐藥檢測是分離和培養臨床毒株。但是，這些檢測需要采集獻血者新鮮的外周血單個核細胞，這將耗時耗力。最近，有一些檢測基于重組病毒的單環感染，或用感染性粒子進行多輪感染。盡管這些檢測用于表型耐藥分析有巨大的應用前景，但是，由于采用高通量定量螢火蟲螢光素酶表達系統，成本還是很高昂，再就是可能存在著生物安全問題。
技術實現思路
為了解決上述現有技術的不足，本專利技術提供了一種轉移質粒，其報告基因Luciferase與ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV啟動子控制報告基因Luciferase與ZsGreen的表達，使得HIV-1抑制劑的抗病毒效果能夠簡易地通過在倒置熒光顯微鏡下觀察到或通過測定熒光素酶活性而獲得，將pol區導入后，多種細胞用具有此轉移質粒的重組慢病毒均可進行耐藥性檢測，通用性強。本專利技術還提供了一種轉移質粒的構建方法及重組慢病毒。本專利技術所要解決的技術問題通過以下技術方案予以實現：本專利技術的專利技術思路基于以下考慮。第一，在艾滋病人臨床治療工作中，表型耐藥檢測能為患者個體化治療提供參考。但是表型耐藥檢測是分離和培養臨床毒株。但是，以往的檢測方法存在耗時耗力或是成本高昂，及生物安全性的問題。基于此，專利技術人開發了一種具有新的轉移質粒的重組慢病毒，它具有簡易操作性、較好的生物安全性及通用性。一種轉移質粒，其結構如圖1所示。一種轉移質粒的構建方法，包括以下步驟：使用BamHI和KpnI雙酶切pMD2.G質粒，回收酶切產物，收取119bpCMV片段；將pHAGE-EF1α-IRES-ZsGreen質粒用BamHI和KpnI進行雙酶切，回收4736bppHAGE-IRES-ZsGreen片段；將回收的CMV片段和pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA連接酶進行連接，連接成功后，提取的質粒命名為pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen質粒；使用NcoI和XbaI雙酶切PGL3-PromoterVector，回收1906bpLuciferase片段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen質粒用NcoI和XbaI雙酶切，回收4855bp的片段，將該片段和Luciferase片段用T4DNA連接酶進行連接；連接成功后，提取的質粒即為pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen。一種重組慢病毒，是包裝質粒、包膜質粒和所述的轉移質粒共轉染293FT細胞或293T細胞后得到的包裝體；其中，所述包裝質粒為psPAX2m-pol質粒。進一步地，所述psPAX2m-pol質粒結構如圖3所示。進一步地，所述psPAX2m-pol質粒序列如SEQIDNo.6所示。進一步地，所述psPAX2m-pol質粒的構建方法，包括以下步驟：(1)psPAX2載體重建：利用長引物法突變psPAX2載體的酶切位點AgeI，獲得psPAX2-1載體；利用定點突變試劑盒突變psPAX2-1載體的酶切位點ApaI，獲得psPAX2-2載體；DpnI酶切psPAX2-2載體，酶切產物轉化XL10-GOLD感受態細胞，質粒提取，ApaI酶切該質粒，挑取酶切產物鑒定測序，獲得psPAX2m載體，其序列如SEQIDNo.4所示；(2)psPAX2m-pol質粒構建：利用PCR擴增pol片段，其序列如SEQIDNo.5所示；用ApaI和AgeI酶切擴增后的pol片段回收并插入psPAX2m載體，得到psPAX2m-pol質粒，其序列如SEQIDNo.6所示。進一步地，所述psPAX2-1載體的序列如SEQIDNo.2所示。進一步地，所述psPAX2-2載體的序列如SEQIDNo.3所示。進一步地，所述psPAX2m載體的序列如SEQIDNo.4所示。進一步地，所述長引物法突變psPAX2載體所用的引物為AgeI-F和AgeI-R，其中，AgeI-F：CGAAGAGCTCATCAGAACAGTCAGACTCATCAAGCTTCTCTATC；AgeI-R：CTGCTAGCTATAGTTCTAGAGGTATCGGTTGTTTCGAGCTTATAG；模板為psPAX2，PCR條件：94℃預變性4min，94℃變性20s、55℃退火20s、72℃延伸1min，循環35次，最后72℃延伸5min；所述利用定點突變試劑盒突變psPAX2-1載體所用的引物為M-ApaI-F和M-ApaI-R；其中，M-ApaI-F：GCCTTGAGGGGCCTCCGGGGACGGCCCTTTGTGCGGGGM-ApaI-R：CCCCGCACAAAGGGGCCGTCCCGGAGCCCCCTCAAGGC；模板為psPAX2-1，PCR條件：95℃預變性2min，95℃變性30sec，55℃退火1min，68℃延伸10min，循環18次。本專利技術具有如下有益效果：該轉移質粒的報告基因Luciferase與ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV啟動子控制報告基因Luciferase與ZsGreen的表達，使得HIV-1抑制劑的抗病毒效果能夠簡易地通過在倒置熒光顯微鏡下觀察到或通過測定熒光素酶活性而獲得；將pol區導入后本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種轉移質粒，其特征在于，其結構如圖1所示。

【技術特征摘要】
1.一種轉移質粒，其特征在于，其結構如圖1所示。
2.一種如權利要求1所述的轉移質粒的構建方法，包括以下步驟：使用BamHI和KpnI
雙酶切pMD2.G質粒，回收酶切產物，收取119bpCMV片段；將pHAGE-EF1α-IRES-ZsGreen質粒
用BamHI和KpnI進行雙酶切，回收4736bppHAGE-IRES-ZsGreen片段；將回收的CMV片段和
pHAGE-IRES-ZsGreen用T4DNA連接酶進行連接，連接成功后，提取的質粒命名為pHAGE-
CMV-IRES-ZsGreen質粒；使用NcoI和XbaI雙酶切PGL3-PromoterVector，回收1906bp
Luciferase片段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen質粒用NcoI和XbaI雙酶切，回收4855bp的片段，
將該片段和Luciferase片段用T4DNA連接酶進行連接；連接成功后，提取的質粒即為
pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen。
3.一種重組慢病毒，其特征在于，是包裝質粒、包膜質粒和如權利要求1所述的轉移質
粒共轉染293FT細胞或293T細胞后得到的包裝體；其中，所述包裝質粒為psPAX2m-pol質粒。
4.根據權利要求3所述的重組慢病毒，其特征在于，所述psPAX2m-pol質粒結構如圖3所
示。
5.根據權利要求3所述的重組慢病毒，其特征在于，所述psPAX2m-pol質粒序列如SEQ
IDNo.6所示。
6.根據權利要求3所述的重組慢病毒，其特征在于，所述psPAX2m-pol質粒的構建方法，
包括以下步驟：
psPAX2載體重建：利用長引物法突變psPAX2載體的酶切位點AgeI，獲得psPAX2-1載體；
利用定點突變試劑盒突變psPAX2-1載體的酶切位點ApaI，獲得psPAX2-2載體；DpnI酶切
psPAX2-2載體，酶切產物轉化XL10-GOLD感...

【專利技術屬性】
技術研發人員：黎誠耀，翁云層，張玲，李金峰，
申請(專利權)人：南方醫科大學，
類型：發明
國別省市：廣東;44