用于檢測(cè)人類ADRB1基因 G1165C多態(tài)性的核酸、試劑盒及方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了用于檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C多態(tài)性的核酸及試劑盒，同時(shí)建立具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C多態(tài)性的檢測(cè)方法。本發(fā)明專利技術(shù)設(shè)計(jì)的人類ADRB1基因G1165C多態(tài)性檢測(cè)試劑盒適用于臨床多種樣本類型選擇，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)周期短，操作簡(jiǎn)單，安全無(wú)毒，成本低等顯著優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明專利技術(shù)提供的檢測(cè)方法采用完全閉管操作，操作簡(jiǎn)單、方便快捷、通過直接探測(cè)PCR過程中熒光信號(hào)值的獲得檢測(cè)的結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測(cè)，克服了常規(guī)PCR技術(shù)的易污染、出現(xiàn)假陽(yáng)性，能有效避免非特異性擴(kuò)增難題，并且適合大批量樣本的檢測(cè)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，具體涉及一種用于檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C多態(tài)性的核酸、試劑盒及方法。
技術(shù)介紹
心腦血管疾病是心臟血管和腦血管疾病的統(tǒng)稱，泛指由于高脂血癥、血液黏稠、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等所導(dǎo)致的心臟、大腦及全身組織發(fā)生的缺血性或出血性疾病，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬(wàn)人，居全球各類死因之首。高血壓是心腦血管疾病的重要病因和危險(xiǎn)因素，長(zhǎng)期高血壓能影響心、腦、腎等器官的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致這些器官功能衰竭，是心腦血管病患者死亡的主要原因之一。心力衰竭是一種因心臟泵血不足而導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積，動(dòng)脈系統(tǒng)血液灌注不足的復(fù)雜臨床綜合征，合并有神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的異常改變，是包括高血壓、冠心病、心肌病在內(nèi)的大多數(shù)心血管疾病的終末階段。腎上腺素能受體是一類介導(dǎo)兒茶酚胺作用的G-蛋白耦聯(lián)型組織受體，根據(jù)其對(duì)去甲腎上腺素的不同反應(yīng)情況分為α和β兩類。其中，α受體分為α1和α2兩個(gè)亞型，β受體分為β1、β2和β3三個(gè)亞型。ADRB1是β1腎上腺素能受體基因，其編碼的功能蛋白由477個(gè)氨基酸殘基組成，在心肌細(xì)胞中大量表達(dá)，也是目前臨床上治療多種心腦血管疾病的β受體拮抗藥物的主要作用靶點(diǎn)。ADRB1基因最常見的單核苷酸多態(tài)性(SNP)為G1165C(rs1801253)位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的第389位氨基酸由甘氨酸變成精氨酸(Gly389Arg)。到目前為止，已有眾多研究結(jié)果表明，β腎上腺素能受體的基因多態(tài)性會(huì)影響β受體阻滯劑的治療效果，進(jìn)而影響心衰患者的愈后。2003年發(fā)表的多篇相關(guān)臨床試驗(yàn)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，高血壓患者在服用美托洛爾后，389Arg純合基因型患者的血壓下降值，比同等條件下其他基因型患者明顯提高，并且389Arg純合基因型的健康人群，在口服阿替洛爾后的血壓下降值，也明顯高于其他基因型人群。2006年，有研究者發(fā)現(xiàn)，389Arg純合基因型的心衰患者，在使用布新洛爾治療后心功能有了明顯改善，其死亡率顯著低于其他基因型患者。綜上所述，ADRB1的基因多態(tài)性，雖然在高血壓和心衰的發(fā)生中不起主要作用，但能修飾β受體阻滯劑相關(guān)的臨床表型，如β受體阻滯劑對(duì)高血壓患者血壓的降低效果，對(duì)心衰患者短期心功能的改善和長(zhǎng)期生存率的提高，對(duì)臨床指導(dǎo)個(gè)體化醫(yī)療和治療效果評(píng)估有重要指導(dǎo)意義。目前市面上用于檢測(cè)ADRB1基因多態(tài)性(G1165C)的方法主要有直接測(cè)序法、基因芯片和液相芯片法。直接測(cè)序的方法雖然結(jié)果測(cè)序結(jié)果較為準(zhǔn)確，但其檢測(cè)靈敏度低，易出現(xiàn)假陰性，操作流程較復(fù)雜，樣品易污染，耗時(shí)較長(zhǎng)，且檢測(cè)成本較高。基因芯片法和液相芯片法同樣操作過程復(fù)雜，檢測(cè)成本高，檢測(cè)周期長(zhǎng)，且結(jié)果準(zhǔn)確性不高，容易發(fā)生樣品污染。以上缺點(diǎn)限制了這三種方法在實(shí)際臨床工作中的發(fā)展和應(yīng)用，無(wú)法滿足快速指導(dǎo)臨床評(píng)估的需求。因此，一種快速、準(zhǔn)確且低成本的新型檢測(cè)方法成為了迫切需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為克服以上現(xiàn)有檢測(cè)人類ADRB1基因多態(tài)性方法的不足，本專利技術(shù)的目的是提供一組用于檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C多態(tài)性的核酸。本專利技術(shù)的另一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C多態(tài)性的試劑盒及其檢測(cè)方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：一組用于檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C多態(tài)性的核酸，該核酸包括檢測(cè)針對(duì)ADRB1基因G1165C的野生型下游引物、突變型下游引物、公用上游引物和公用檢測(cè)探針，其中，所述野生型下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述突變型下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述公用上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述公用檢測(cè)探針的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。如上所述的核酸，優(yōu)選的，所述核酸還包括內(nèi)部質(zhì)控，所述內(nèi)部質(zhì)控包括質(zhì)控引物對(duì)和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示。如上所述的核酸，優(yōu)選的，所述核酸還包括野生型陽(yáng)性對(duì)照物、突變型陽(yáng)性對(duì)照物和質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照物，其中，所述野生型陽(yáng)性對(duì)照物含有如SEQIDNo.8所示的核苷酸序列，所述突變型陽(yáng)性對(duì)照物含有如SEQIDNo.9所示的核苷酸序列，和/或所述質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照物含有如SEQIDNo.10所示的核苷酸序列。一種用于檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C多態(tài)性的試劑盒，該試劑盒用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C的野生型和突變型，所述試劑盒包括如上所述的核酸，所述公用檢測(cè)探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)，和/或質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于所述公用檢測(cè)探針的熒光基團(tuán)，3＇端連接有不同于所述公用檢測(cè)探針的淬滅基團(tuán)。如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述試劑盒還包括：PCR緩沖液、DNA聚合酶、礦物油、陰性對(duì)照物：超純水。如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述熒光基團(tuán)為FAM、JOE、VIC、CY3、JUN、ROX、HEX中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。一種檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C多態(tài)性的方法，該方法包括以下步驟：(1)從樣品中提取DNA；(2)對(duì)提取的所述DNA，同時(shí)進(jìn)行野生型體系和突變型體系的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；其中，所述野生型體系中野生型引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.3所示，公用檢測(cè)探針的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述反突變型體系中突變型引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示，公用檢測(cè)探針的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述公用檢測(cè)探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)；(3)收集熒光信號(hào)，選擇對(duì)應(yīng)熒光基團(tuán)的熒光檢測(cè)模式，基線調(diào)整取3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；(4)結(jié)果判定：待測(cè)樣品的所述野生型反應(yīng)體系和所述突變型反應(yīng)體系的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所需的循環(huán)次數(shù)Ct值的差值△Ct值來確定樣本DNA的基因型。如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，所述野生型體系和所述突變型體系還包括有作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對(duì)和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，該質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于所述公用檢測(cè)探針的熒光基團(tuán)，3＇端連接有不同于所述公用檢測(cè)探針的淬滅基團(tuán)。如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，在各自的所述野生型體系和所述突變型體系中，各條引物和探針的終濃度為100-1000nmol/L；所述熒光基團(tuán)為FAM、JOE、VIC、CY3、JUN、ROX、HEX中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。如上所述的方法，優(yōu)選地，步驟(2)中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝浑A段：95℃4min；第二階段：95℃5s，58℃30s，10個(gè)循環(huán)；第三階段：95℃30s，58℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；信號(hào)收集：第三階段72℃時(shí)收集熒光信號(hào)。如上所述的方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，在各自所述野生型體系和所述突變型體系中，所述野生型引物對(duì)的終濃度均為200nmol/本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一組用于檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C多態(tài)性的核酸，其特征在于，該核酸包括檢測(cè)針對(duì)G1165C的野生型下游引物、突變型下游引物、公用上游引物和公用檢測(cè)探針，其中，所述野生型下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，所述突變型下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，所述公用上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，所述公用檢測(cè)探針的核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一組用于檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C多態(tài)性的核酸，其特征在于，該核酸包括檢測(cè)針對(duì)G1165C的野生型下游引物、突變型下游引物、公用上游引物和公用檢測(cè)探針，其中，所述野生型下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述突變型下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述公用上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述公用檢測(cè)探針的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。2.如權(quán)利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸還包括內(nèi)部質(zhì)控，所述內(nèi)部質(zhì)控包括質(zhì)控引物對(duì)和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQIDNo.7所示。3.如權(quán)利要求1或2所述的核酸，其特征在于，所述核酸還包括野生型陽(yáng)性對(duì)照物、突變型陽(yáng)性對(duì)照物和質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照物，其中，所述野生型陽(yáng)性對(duì)照物含有如SEQIDNo.8所示的核苷酸序列，所述突變型陽(yáng)性對(duì)照物含有如SEQIDNo.9所示的核苷酸序列，和/或所述質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照物含有如SEQIDNo.10所示的核苷酸序列。4.一種用于檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，該試劑盒用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C的野生型和突變型，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1-3中任一所述的核酸，所述公用檢測(cè)探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)，和/或質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于所述公用檢測(cè)探針的熒光基團(tuán)，3＇端連接有不同于所述公用檢測(cè)探針的淬滅基團(tuán)。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：PCR緩沖液、DNA聚合酶、礦物油、陰性對(duì)照物：超純水；所述熒光基團(tuán)為FAM、JOE、VIC、CY3、JUN、ROX、HEX中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。6.一種檢測(cè)人類ADRB1基因G1165C多態(tài)性的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：(1)從樣品中提取DNA；(2)對(duì)提取的所述DNA，同時(shí)進(jìn)行野生型體系和突變型體系的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；其中，所述野生型體系中野生型引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.3所示，公用檢測(cè)探針的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述反突變型體系中突變型引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示，公用檢測(cè)探針的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述公用檢測(cè)探針的5＇端連接熒光基團(tuán)，3＇端連接淬滅基團(tuán)；(3)收集熒光信號(hào)，選擇對(duì)應(yīng)熒光基團(tuán)的熒光檢測(cè)模式，基線調(diào)整取3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定閾值線；(4)結(jié)果判定：待測(cè)樣品的所述野生型反應(yīng)體系和所述突變型反應(yīng)體系的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李惠，鄒芳，楊惠娟，段衛(wèi)濤，趙平鋒，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：武漢海吉力生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：湖北;42