芝麻微衛星標記位點開發方法與微衛星標記位點內的微衛星標記的長度檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種芝麻微衛星標記位點開發方法與微衛星標記位點內的微衛星標記的長度檢測方法。所述開發方法包括：獲得混合樣本；提取混合樣本的基因組；將基因組片段化，獲得基因組片段；利用探針組分別與基因組片段進行雜交；純化多個雜交溶液中成功雜交的基因組片段；將多個所述純化的雜交基因組片段混合后，利用高通量測序檢測所述純化的基因組片段；獲得有效的所述高通量測序片段；將所述有效的高通量測序片段進行分類。所述檢測方法包括：選擇待檢測的微衛星標記位點；利用多重擴增引物擴增所述待檢測的微衛星標記位點內的微衛星標記，獲得所述微衛星標記位點內的微衛星標記的長度。上述方法簡單、快速、全面且準確。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，特別涉及一種芝麻微衛星標記位點開發方法與微衛星標記位點內的微衛星標記的長度檢測方法。
技術介紹
微衛星標記又稱短串聯重復序列(shorttandemrepeats，STR)或簡單重復序列(simplesequencerepeats，SSR)，指由2個以上核苷酸為重復單元串聯重復構成。微衛星標記位點指的是在基因組上含有微衛星標記的座位，微衛星標記位點在基因組上數量豐富且均勻分布，微衛星標記位點的開發指的是尋找基因組上的微衛星標記位點的過程。不同樣本中，同一個微衛星標記位點內的微衛星標記的重復單元的重復次數可能不同，在樣本間存在長度變異，因此微衛星標記位點的多態性主要指同一個微衛星標記位點的不同微衛星標記的長度多態性。微衛星標記檢測技術指的是檢測微衛星標記位點中的微衛星標記的長度的技術。不同樣本的微衛星標記的長度多態性可以用來對樣本的身份進行鑒定，因此，微衛星標記技術的應用十分廣泛，包括生物多樣性鑒定、動植物品種指紋身份證鑒定等等。傳統的芝麻微衛星標記位點的開發與檢測包括以下步驟：基因組提取、基因組片段化、連接接頭、擴增、與簡單重復序列雜交、純化雜交產物、雜交產物克隆、克隆產物大腸桿菌轉化、挑取單克隆、對每一個單克隆的目標位點進行一代測序、分析測序結果獲得微衛星標記位點、在多個芝麻樣本中檢驗微衛星標記位點的多態性、開發出多態性高的微衛星標記位點、逐一擴增并電泳檢測每一個待檢測的樣品中的每一個待檢測的微衛星標記位點中的微衛星標記。在實現本專利技術的過程中，專利技術人發現現有技術至少存在以下問題：芝麻微衛星標記位點的開發與檢測流程復雜、通量低、極其耗時費力；其次，微衛星標記位點的電泳檢測的分辨率低，檢測結果不準確，準確的結果需要參考樣本等進行校正。由此派生的問題包括：開發出來的微衛星標記位點少，通常200個以內，占基因組上所有微衛星標記位點的1％左右；用于檢驗微衛星標記位點多態性的芝麻樣本也少，通常在數十個左右，因此多態性檢證結果不準確；微衛星標記位點的側翼序列保守性未知，影響擴增微衛星標記位點的引物的通用性；檢測的微衛星標記位點的數量有限，一般在一個待檢測的樣品中檢測數十個微衛星標記位點，導致建立的樣本的DNA身份證信息不完整、不準確。
技術實現思路
為了解決現有技術的問題，本專利技術實施例提供了一種芝麻微衛星標記位點開發方法與微衛星標記位點內的微衛星標記的長度檢測方法。所述技術方案如下：一方面，本專利技術實施例提供了一種芝麻微衛星標記位點開發方法，所述方法包括：將n個具有多態性的芝麻樣本等質量混合，獲得混合樣本，其中n＞1；提取所述混合樣本的基因組；將所述混合樣本的基因組片段化，獲得基因組片段；將多個具有簡單重復序列的探針作為探針組，利用所述探針組中的每個探針分別與所述基因組片段進行雜交，獲得多個雜交溶液，對多個所述雜交溶液中成功雜交的基因組片段分別進行純化，得到多個純化的雜交基因組片段；將多個所述純化的雜交基因組片段等質量混合后，利用高通量測序檢測混合后的所述純化的雜交基因組片段，獲得第一高通量測序片段；從所述第一高通量測序片段中，篩選有效的所述高通量測序片段，所述有效的高通量測序片段包括微衛星標記位點內的微衛星標記；根據所述有效的高通量測序片段中的微衛星標記的兩側序列的同源性對所述有效的高通量測序片段進行分類，同一類的所述有效的高通量測序片段為同一個微衛星標記位點的所述有效的高通量測序片段，若同一個所述微衛星標記位點的所述有效的高通量測序片段的條數≥α1，則成功開發一個所述微衛星標記位點，其中，α1為第一判定閾值且α1≥(高通測序深度×有效的高通量測序片段的比例/基因組上能檢測到的微衛星標記位點數)×概率保證。通常，為了便于純化所述雜交溶液中成功雜交的基因組片段，可以對探針進行功能化標記，例如可以利用生物素標記的具有簡單重復序列的探針與所述基因組片段進行雜交，獲得雜交溶液；利用鏈霉親和素磁珠純化所述雜交溶液中成功雜交的基因組片段，獲得純化的基因組片段。在上述步驟中由于探針具有生物素標記，使得成功雜交的基因組片段也被生物素標記，從而可以利用鏈霉親和素磁珠從所述雜交溶液中純化出來。所述利用生物素標記和鏈霉親和素磁珠純化的技術為公知技術。具體地，α1≥20。具體地，所述微衛星標記指由≥2個堿基組成的重復單元串聯重復構成的序列。具體地，所述有效的高通量測序片段中的所述微衛星標記的兩側序列的堿基數均≥1個，且所述有效的高通量測序片段中的所述微衛星標記中至少有一側的序列的堿基數≥10個。具體地，選擇所述n個具有多態性的芝麻樣本的方法包括：選擇外部形態不同的芝麻樣本、生物分類不同的芝麻樣本、標記互不相同的芝麻樣本或不同生態區域的野生資源的芝麻樣本。具體地，所述探針的數量為12個，每個所述探針的簡單重復序列中的重復單元為CT、GA、TG、AC、TA、TGT、CCA、ATC、CCT、AGA、ATG或CAA，每個所述探針的簡單重復序列的重復次數為6～20，優選為6～15，例如重復次數為8或12。具體地，所述探針的序列如序列表中SEQINNO:1-SEQINNO:12所示。另一方面，本專利技術實施例提供了一種上述開發方法成功開發的微衛星標記位點內的微衛星標記的長度檢測方法，所述檢測方法包括：從成功開發的所述微衛星標記位點中，選擇待檢測的微衛星標記位點；利用多重擴增引物擴增所述待檢測的微衛星標記位點內的微衛星標記，得到擴增產物，將所述擴增產物進行高通量測序，得到第二高通量測序片段，通過分析所述第二高通量測序片段，獲得所述微衛星標記位點內的微衛星標記的長度。具體地，所述從成功開發的所述微衛星標記位點中，選擇所述待檢測的微衛星標記位點的方法包括：選擇所述待檢測的微衛星標記位點的標準為H值最大的所述微衛星標記位點，其中，H值為所述微衛星標記位點的多態性指數，其中，i為按所述微衛星標記位點的所述有效的高通量測序片段中的微衛星標記的長度進行分類時，第i個類別，i為自然數；ai為第i個類別的有效的所述高通量測序片段的數目占總的有效的所述高通量測序片段的數目的比例。具體地，制備所述多重擴增引物的方法包括：從選擇的所述待檢測的微衛星標記位點的所有所述有效的高通量測序片段中，提取所述微衛星標記并挑選出最長的所述微衛星標記作為多重擴增引物的模版序列的微衛星標記；從選擇的所述待檢測的微衛星標記位點的所有所述有效的高通量測序片段中，提取所述微衛星標記的左側序列并挑出長度大于α2個堿基的所有序列，從挑選出的所述所有序列中，挑選出頻率最高的序列，以所述頻率最高的序列作為參考序列，將所述參考序列與所有的所述微衛星標記的左側序列進行比對，在所述頻率最高的序列中獲得每一個堿基的覆蓋倍數和變異頻率；在所述頻率最高的序列中，將所述覆蓋倍數≤1/α3或所述變異頻率≥α3的堿基變為N后作為所述多重擴增引物的模板序列的左側序列，其中，N為A、T、C和G四種堿基中任意一種及以上的堿基；α2為第二判定閾值，α2＝(所述第一高通量測序片段的平均長度-所述多重擴增引物的微衛星標記位點的長度)÷2；α3為第三判定閾值，α3≥5×(1-所述第一高通量測序片段的準確度)；按照與所述多重擴增引物的模板序列的左側序列相同的方法，獲得多重擴增引物序列的模板序列的右側序本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種芝麻微衛星標記位點開發方法，其特征在于，所述開發方法包括：將n個具有多態性的芝麻樣本等質量混合，獲得混合樣本，其中n＞1；提取所述混合樣本的基因組；將所述混合樣本的基因組片段化，獲得基因組片段；將多個具有簡單重復序列的探針作為探針組，利用所述探針組中的每個探針分別與所述基因組片段進行雜交，獲得多個雜交溶液，對多個所述雜交溶液中成功雜交的基因組片段分別進行純化，得到多個純化的雜交基因組片段；將多個所述純化的雜交基因組片段等質量混合后，利用高通量測序檢測混合后的所述純化的雜交基因組片段，獲得第一高通量測序片段；從所述第一高通量測序片段中，篩選有效的所述高通量測序片段，所述有效的高通量測序片段包括微衛星標記位點內的微衛星標記；根據所述有效的高通量測序片段中的微衛星標記的兩側序列的同源性對所述有效的高通量測序片段進行分類，同一類的所述有效的高通量測序片段為同一個微衛星標記位點的所述有效的高通量測序片段，若同一個所述微衛星標記位點的所述有效的高通量測序片段的條數≥α1，則成功開發一個所述微衛星標記位點，其中，α1為第一判定閾值且α1≥(高通測序深度×有效的高通量測序片段的比例/基因組上能檢測到的微衛星標記位點數)×概率保證。...

【技術特征摘要】
1.一種芝麻微衛星標記位點開發方法，其特征在于，所述開發方法包括：將n個具有多態性的芝麻樣本等質量混合，獲得混合樣本，其中n＞1；提取所述混合樣本的基因組；將所述混合樣本的基因組片段化，獲得基因組片段；將多個具有簡單重復序列的探針作為探針組，利用所述探針組中的每個探針分別與所述基因組片段進行雜交，獲得多個雜交溶液，對多個所述雜交溶液中成功雜交的基因組片段分別進行純化，得到多個純化的雜交基因組片段；將多個所述純化的雜交基因組片段等質量混合后，利用高通量測序檢測混合后的所述純化的雜交基因組片段，獲得第一高通量測序片段；從所述第一高通量測序片段中，篩選有效的所述高通量測序片段，所述有效的高通量測序片段包括微衛星標記位點內的微衛星標記；根據所述有效的高通量測序片段中的微衛星標記的兩側序列的同源性對所述有效的高通量測序片段進行分類，同一類的所述有效的高通量測序片段為同一個微衛星標記位點的所述有效的高通量測序片段，若同一個所述微衛星標記位點的所述有效的高通量測序片段的條數≥α1，則成功開發一個所述微衛星標記位點，其中，α1為第一判定閾值且α1≥(高通測序深度×有效的高通量測序片段的比例/基因組上能檢測到的微衛星標記位點數)×概率保證。2.根據權利要求1所述的開發方法，其特征在于，α1≥20。3.根據權利要求1所述的開發方法，其特征在于，所述有效的高通量測序片段中的所述微衛星標記的兩側序列的堿基數均≥1個，且所述有效的高通量測序片段中的所述微衛星標記中至少有一側的序列的堿基數≥10個。4.根據權利要求1所述的開發方法，其特征在于，選擇所述n個具有多態性的芝麻樣本的方法包括：選擇外部形態不同的芝麻樣本、生物分類不同的芝麻樣本、標記互不相同的芝麻樣本或不同生態區域的野生資源的芝麻樣本。5.根據權利要求1所述的開發方法，其特征在于，所述探針的數量為12個，每個所述探針的簡單重復序列中的重復單元為CT、GA、TG、AC、TA、TGT、CCA、ATC、CCT、AGA、ATG或CAA，每個所述探針的簡單重復序列的重復次數為6～20；優選地，每個所述探針的簡單重復序列的重復次數為6～15。6.根據權利要求1所述的開發方法，其特征在于，所述探針的序列如序列表中SEQINNO:1-SEQINNO:12所示。7.一種權利要求1-6任一項所述的開發方法成功開發的微衛星標記位點內的微衛星標記的長度檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括：從成功開發的所述微衛星標記位點中，選擇待檢測的微衛星標記位點；利用多重擴增引物擴增所述待檢測的微衛星標記位點內的微衛星標記，得到擴增產物，將所述擴增產物進行高通量測序，得到第二高通量測序片段，通過分析所述第二高通量測序片段，獲得所述微衛星標記位點內的微衛星標記的長度。8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述從成功開發的所述微衛星標記位點中，選擇待檢測的微衛星標記位點的方法包括：選擇所述待檢測的微衛星標記位點的標準為H值最大的所述微衛星標...

【專利技術屬性】
技術研發人員：高利芬，張靜，方治偉，李甜甜，李論，周俊飛，
申請(專利權)人：江漢大學，
類型：發明
國別省市：湖北;42