一種苯環己哌啶單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其制備方法技術

本發明專利技術公開了一種苯環己哌啶(Phencyclidine，簡稱PCP)單克隆抗體的制備方法，該抗體是采用PCP與牛甲狀腺球蛋白(BTG)共價連接的偶聯蛋白PCP-BTG為免疫原，免疫Balb/c小鼠，取其脾臟細胞與sp2/0骨髓瘤細胞融合，篩選得到1株穩定分泌PCP單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發明專利技術所得單克隆抗體能特異性識別PCP分子，可用于PCP的特異性檢測，特異性高，反應靈敏，實驗成本低，適合高通量快速檢測。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬免疫學
，特別是一種苯環己哌啶單克隆抗體的制備方法，所得單克隆抗體可應用于免疫膠體金法檢測苯環已哌啶。
技術介紹
苯環己哌啶(Phencyclidine,PCP)，是毒品中的一種,俗稱天使毒品、霸王毒品。PCP原是一種獸用鎮靜劑，但它被人體吸收時，會產生嚴重和長期的行為問題，如智力遲鈍、知覺錯誤、偏執狂、精神病、敵對心理和暴力行為等。苯環己哌啶首次合成于1957年，由于他所具有的精神和迷幻效應，1965美國法律禁止苯環己哌啶用于人類，只限于獸醫領域，用于麻醉動物。之后，由于它具有明顯的副作用，苯環己哌啶甚至也不再用于獸醫領域?，F在多出現在娛樂場所，服用方式為口服。毒品問題一直是危及全球的嚴重社會問題。在強力打擊販賣毒品者的同時，現場快速檢測毒品也是迫切需要解決的問題。利用毒品和毒品代謝物的抗體來檢測吸毒者尿液中的抗原物質(毒品和毒品代謝物)是毒品檢測中較為常用的免疫檢測方法，其中免疫層析膠體金技術是目前新興的，可方便快速準確地檢測毒品的方法。而應用單克隆抗體技術獲取高靈敏度，高特異性的抗體是研制免疫層析膠體金試紙的關鍵。由于PCP分子較小，不易引起小鼠產生相應的體液免疫反應，本專利技術以PCP與牛甲狀腺球蛋白(BTG)共價連接的偶聯蛋白PCP-BTG為免疫原，通過免疫Balb/c小鼠，用聚乙二醇融合，篩選靈敏度高，特異性強可以同時和小分子PCP以及偶聯蛋白結合的單克隆抗體。>
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種苯環已哌啶(PCP)單克隆抗體的制備方法。由該方法所得的PCP抗體反應靈敏度高，特異性強，成本低，可大規模制備作為免疫層析膠體金檢測試紙的原料。PCP單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)用外購抗原(PCP-BTG)免疫Balb/c小鼠，多次免疫小鼠眼球采血測定血清效價后，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合，并用HAT篩選得到穩定的雜交瘤細胞株；(2)用ELISA法篩選陽性細胞株，克隆得到穩定的雜交瘤細胞株；(3)將雜交瘤細胞株注射到液體石蠟預處理的F1小鼠腹腔，隔周取腹水，3.3％辛酸沉淀和50％飽和硫酸銨沉淀法純化單抗，得到單克隆抗體。本專利技術篩選方法為ELISA法，采用免疫的抗原PCP-BTG包被，檢測樣品里的抗體，同時加入小分子PCP，檢測PCP-BTG以及小分子PCP對于抗體的的競爭結合能力。本專利技術采用PCP-BTG作為抗原免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞sp2/0進行融合，篩選出1株能夠分泌針對PCP小分子有特異性反應的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，從注射雜交瘤細胞株后的動物腹水中純化得到單克隆抗體。本專利技術的PCP可用于各種免疫測定法，例如免疫層析膠體金法。在一個具體實施例中，建立了競爭膠體金法檢測體系。純化單抗通過金標記，點在金標墊上，和點在NC膜上的自制抗原PCP-BGG配對，可以檢測25ng/mlcutoffPCP小分子。本專利技術通過辛酸沉淀和50％飽和硫酸銨沉淀方法從動物腹水中獲得高純度抗體，并且實現了抗體的大量制備。本專利技術的苯環己哌啶單克隆抗體還可用于其他免疫學檢測體系。另一方面，本專利技術提供一種產生結合苯環己哌啶單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號碼為CCTCCNO：C2015135的雜交瘤細胞株PCP1310。有益效果本專利技術的抗體靈敏度高，特異性強可以同時和小分子PCP以及偶聯蛋白結合。對于保藏細胞株的生物學特性說明雜交瘤細胞株PCP1310保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號碼為CCTCCNO：C2015135，地址：中國武漢武漢大學，保藏日期為：2015年8月21日。具體實施方式實施例1篩選針對PCP的雜交瘤細胞株1.1用PCP-BTG(購買自Immunetics公司)免疫小鼠取6～8周雌性BALB/C小鼠(購自上海動物中心)，首次免疫皮下多點注射福氏完全佐劑乳化的PCP-BTG，100ug/只，后續免疫每兩周對小鼠進行腹腔注射不完全福氏佐劑充分乳化的PCP-BTG，100ug/只，第四次免疫后小鼠眼球采血，測定血清效價。擇血清效價較好的小鼠加強免疫，脾臟內注射PCP-BTG，50ug/只。1.2細胞融合1.2.1飼養細胞的制備小鼠摘眼球處死，浸泡于75％酒精中消毒5min，撕開小鼠腹外皮膚，暴露其腹膜，用無菌注射器注入5mL37℃預熱的DMEM無血清培養基(該過程切記不能刺破內臟，否則細胞可能被內臟污染)，輕揉小鼠腹腔，懸浮腹腔細胞，吸出腹腔液。1500rpm離心3min，用15％胎牛血清DMEM的培養液重懸。1.2.2脾細胞的制備摘眼球處死經加強免疫的小鼠，無菌分離出脾臟，75％酒精洗滌，再用無血清DMEM培養液淋洗，置于篩網上研碎，將脾臟細胞沖洗入無菌離心管，1500rpm離心3min，用無血清DMEM培養液重懸，計數，調整細胞濃度至2×108。1.2.3細胞融合將骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按1：4比例混合，在無菌的50mL離心管中用無血清DMEM培養基洗一次，1500rpm離心3min，棄上清，盡量不要有殘留液體，輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀松動。置于37℃水浴，在90s內緩緩加入37℃預溫的1mLPEG1500，邊加邊輕微搖動。加入一定量37℃預溫的無血清DMEM培養基終止PEG作用。離心，1500rpm離心3min，棄上清。1.3陽性克隆的篩選1.3.1細胞培養用15％胎牛血清HAT選擇培養基重懸細胞沉淀，加入飼養細胞。將該細胞加到96孔板內，每孔200uL，將培養板置于37℃，5％CO2培養箱中培養。在15％胎牛血清HAT選擇培養基中維持3天左右，鏡檢，觀察到瘤細胞基本死亡，雜交瘤細胞形成小集落，此時換用15％胎牛血清HT培養基，每孔100uL。1.3.2陽性克隆的篩選和亞克隆采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測各孔抗體效價。抗原包被與封閉：PCP-BTG用包被液(0.05M碳酸緩沖液pH9.6)稀釋成1ug/mL，50uL/孔，37℃4小時；配制BSA(1％M/V)封閉液，甩去孔中包被液，拍干后，加入封閉液，200uL/孔，4℃過夜封閉，此后甩去封閉液，包被完成。對于檢測陽性的雜交瘤細胞株，再使用有限稀釋法進行亞克隆，經過六次克隆后，共篩選得到1株雜交瘤細胞株PCP1310，保藏號碼為CCTCCNO：C2015135，細胞上清效價及競本文檔來自技高網...

【技術保護點】
PCP單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)用外購抗原(PCP?BTG)免疫Balb/c小鼠，多次免疫小鼠眼球采血測定血清效價后，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合，并用HAT篩選得到穩定的雜交瘤細胞株；(2)用ELISA法篩選陽性細胞株，克隆得到穩定的雜交瘤細胞株；(3)將雜交瘤細胞株注射到液體石蠟預處理的F1小鼠腹腔，隔周取腹水，3.3％辛酸沉淀和50％飽和硫酸銨沉淀法純化單抗，得到單克隆抗體。

【技術特征摘要】
1.PCP單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)用外購抗原(PCP-BTG)免疫Balb/c小鼠，多次免疫小鼠眼球采血測定血
清效價后，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合，并用HAT篩選得到穩定
的雜交瘤細胞株；
(2)用ELISA法篩選陽性細胞株，克隆得到穩定的雜交瘤細胞株；
(3)將雜交瘤細胞株注射到液體石蠟預處理的F1小鼠腹腔，隔周取腹水，3.3％
辛酸沉淀和50％飽和硫酸銨沉淀法純化單抗，得到單克隆抗體。
2.如權利要...

【專利技術屬性】
技術研發人員：戈東平，郭強強，陸啟明，
申請(專利權)人：艾博生物醫藥杭州有限公司，
類型：發明
國別省市：浙江;33