一種融合蛋白及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種融合蛋白及其應用。所述融合蛋白包括超正電荷綠色熒光蛋白、流感病毒血凝素HA2亞基和天花粉蛋白。本發明專利技術將超正電荷綠色熒光蛋白、流感病毒血凝素HA2亞基與天花粉蛋白融合，獲得的融合蛋白能高效穿過細胞膜進入腫瘤細胞，大大增強了其抗腫瘤活性，降低有效藥物濃度。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及基因工程
，特別是涉及一種融合蛋白及其應用。
技術介紹
天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是從葫蘆科栝樓屬植物栝樓(TrlchosanthesKirilowiiMaxim)的根塊中提取出的一種堿性蛋白，屬于I型核糖體失活蛋白。傳統中藥天花粉在我國已有上千年的藥用歷史，歷代古醫書中對其性狀和應用都有詳細的記載。天花粉蛋白最初臨床上主要用于引產及宮外孕等，后來陸續發現它具有廣泛的藥理作用，包括抗病毒，抗腫瘤作用等，其中天花粉蛋白的抗腫瘤作用尤為引人注目。實驗表明，天花粉蛋白對HeLa細胞的生長具有明顯的抑制作用，可以將HeLa細胞阻滯于S期，誘導HeLa細胞發生凋亡(何金峰,李繼承.天花粉蛋白抑制HeLa細胞生長及誘導細胞凋亡之機制探討.解剖學報.2006,37:309)。然而，天然提取的和基因工程表達的未經修飾的天花粉蛋白用于抗腫瘤治療遇到的一個突出問題是，并非所有類型的腫瘤都對天花粉蛋白的細胞毒效應敏感。研究顯示，宮頸癌來源的HeLa細胞對天花粉蛋白敏感，而肝癌來源的HepA-H細胞則不敏感。對這些不敏感的腫瘤，如果單純采用增加天花粉劑量的方法，則有可能導致臨床上無法接受的毒副反應。這種反應的差異性大大限制了天花粉蛋白作為抗腫瘤藥物的使用范圍和效能。一般認為，天花粉蛋白對不同細胞的毒性的差異取決于它能夠穿過細胞膜到達細胞內靶位點的效率，而它的跨膜轉運是由膜受體介導的。因此，如何將天花粉蛋白在分子水平加以改造，使其能夠高效進入腫瘤靶細胞，以通過減量增效而降低其毒副反應，擴大其抗腫瘤臨床應用范圍，具有至關重要的意義。在腫瘤生物治療研究和臨床實踐中，采用蛋白質轉導技術可將治療蛋白高效轉導進入靶細胞。蛋白質轉導技術是將目的蛋白與一段“蛋白轉導肽”(或稱“細胞穿透肽”)在分子水平連接，構成融合蛋白。這樣的融合蛋白能自動穿過細胞膜進入細胞內，而毋需任何其它輔助試劑。迄今已發現多種具有蛋白轉導活性的蛋白或肽成分，但其中研究得最為深入的是衍生于艾滋病毒(HIV)的TAT轉導肽。自從蛋白質轉導技術專利技術以來，TAT肽一直是應用最廣、研究最深入的細胞轉導(穿透)肽。然而，2007年美國哈弗大學的DavidR.Liu實驗室通過研究綠色熒光蛋白(GFP)的分子表面結構，發現在不影響蛋白熒光特性的前提下，把非保守氨基酸替換成一些帶正電荷或負電荷的氨基酸，得到一些“超電荷蛋白”(LawrenceMS,PhillipsKJ,LiuDR.Superchargingproteinscanimpartunusualresilience.JAmChemSoc.2007；129(33):10110-2)。這樣的超電荷蛋白不僅保持原有的熒光等性能，而且獲得了一些不同尋常的新的特性。經過基因工程改造而使表面帶有36個正電荷的超正電荷綠熒光蛋白(+36GFP)由于靜電排斥作用，使蛋白溶液具有更高的穩定性或抗變性特性，而最引人注目的是，+36GFP及其偶聯的融合蛋白也具有細胞轉導/穿透效能，而且其細胞轉導/穿透效能比經典的TAT肽高100倍(CronicanJJ,etal.PotentdeliveryoffunctionalproteinsintoMammaliancellsinvitroandinvivousingasuperchargedprotein.ACSChemBiol.2010；5(8):747-52)，成為迄今最強效的細胞轉導/穿透元件。CN105315377A公開了帶有穿膜肽的天花粉(TCS)融合蛋白、質粒及制備方法與應用。融合蛋白包括TCS與穿膜肽，所述的穿膜肽為人源性穿膜肽，選自ARF、HBD或TAT，所述的融合蛋白中還含有連接肽，所述的連接肽為2個氨基酸到20個氨基酸長度的連接肽，優選為柔性的連接肽。同時，可將帶有穿膜肽的TCS融合蛋白用在制備抗腫瘤藥物中。該專利技術公開的帶有穿膜肽的TCS融合蛋白對部分腫瘤細胞的穿膜能力仍然較弱，例如，該專利技術將人超氧化物歧化酶C端部分氨基酸(HBD)作為穿膜肽與TCS融合，構建的融合蛋白對人肺癌A549細胞株的半數抑制濃度(IC50)為3.8μM，用藥劑量仍然較高，所以需要使TCS穿膜能力更強的穿膜肽(細胞轉導/穿透元件)，從而開發出用藥劑量更低的TCS融合蛋白。
技術實現思路
本專利技術針對現有技術的不足，提供了一種以超正電荷綠色熒光蛋白為細胞轉導/穿透元件的融合蛋白及其應用。一種融合蛋白，包括超正電荷綠色熒光蛋白(+36GFP)、流感病毒血凝素HA2亞基和天花粉蛋白(TCS)。超正電荷綠色熒光蛋白，能夠使融合蛋白穿透細胞膜進入細胞內；流感病毒血凝素HA2亞基，能夠裂解囊泡膜將被內吞體包裹的融合蛋白釋放進細胞漿，從而可以加快融合蛋白發揮作用的速度；天花粉蛋白，能夠透過凋亡機制殺傷靶細胞。所述各元件之間直接連接或者通過連接肽(Linker)進行連接?？紤]到+36GFP和TCS兩部分分子量較大，可能會造成他們在功能上的互相影響，同時也會帶來一些其他問題，如表達量低以及以包涵體形式表達等。優選的，所述的融合蛋白，包括連接肽。連接肽不宜太短或太長，一般以柔性的谷氨酸和絲氨酸為主。優選的，所述的連接肽氨基酸序列如SEQIDNo.5所示。由于所述各元件為獨立發揮作用，只要保證最終的融合蛋白具有較好的蛋白折疊狀態和功能，各元件排列的先后順序可以變換。考慮到各元件發揮作用的先后順序，優選的，所述的融合蛋白，由超正電荷綠色熒光蛋白、流感病毒血凝素HA2、連接肽和天花粉蛋白依次連接組成。為了融合蛋白純化的方便，可以使用親和純化標簽。作為一種優選，所述的融合蛋白，包括組氨酸標簽序列。所述融合蛋白，超正電荷綠色熒光蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，天花粉蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，流感病毒血凝素HA2亞基的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。本專利技術又提供了一種編碼所述融合蛋白的基因。所述的基因，核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。本專利技術還提供了包含所述基因的重組載體和轉化子。本專利技術還提供了所述的融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用。優選的，所述腫瘤為肺癌或黑色素瘤。本專利技術將超正電荷綠色熒光蛋白、流感病毒血凝素HA2亞基與天花粉蛋白融合，獲得的融合蛋白能高效穿過細胞膜進入腫瘤細胞，大大增強了其抗腫瘤活性，降低有效藥物濃度。附圖說明圖1為+36GFP-HA2-TCS融合基因的構建流程圖；圖2為重組質粒構建分子克隆流程圖；圖3為重組質粒pET+36GFP-HA2-本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種融合蛋白，其特征在于，包括超正電荷綠色熒光蛋白、流感病毒血凝素HA2亞基和天花粉蛋白。

【技術特征摘要】
1.一種融合蛋白，其特征在于，包括超正電荷綠色熒光蛋白、流感病毒血凝素HA2亞
基和天花粉蛋白。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，包括連接肽。
3.如權利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，由超正電荷綠色熒光蛋白、流感病毒血
凝素HA2、連接肽和天花粉蛋白依次連接組成。
4.如權利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，包括組氨酸標簽序列。
5.如權利要求1所述融合蛋白，其特征在于，超正電荷綠色熒光蛋白的氨基酸序列如
SEQIDN...

【專利技術屬性】
技術研發人員：閻輝，羅硯曦，
申請(專利權)人：浙江省醫學科學院，
類型：發明
國別省市：浙江;33