新型多肽制造技術

本發明專利技術涉及共價結合至分子支架的多肽，其中兩個或更多個肽環在支架的附著點之間相對。特別地，本發明專利技術描述了對人和大鼠的蛋白酶血漿激肽釋放酶特異的、并且在一個或兩個肽環中存在修飾以增強效能和/或蛋白酶抗性的肽。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及共價結合至分子支架的多肽，其中兩個或更多個肽環在支架的附著點之間相對。特別地，本專利技術描述了特異于人和大鼠蛋白酶血漿激肽釋放酶的并且在一個或兩個肽環中存在修飾以增強效能和/或蛋白酶抗性的肽。
技術介紹
環肽能夠以高親和性和靶標特異性的方式結合蛋白靶標，并且因此是用于治療開發的有吸引力的分子類型。實際上，數個環肽已經成功用于臨床，例如，如抗菌肽萬古霉素，免疫抑制藥物環孢霉素或抗癌藥物奧曲肽(octreotide)(Driggers等人(2008),NatRevDrugDiscov7(7),608-24)。良好的結合特性來自肽和靶標之間形成的相對大的相互作用表面，以及降低的環狀結構構象柔性。典型地，大環結合數百平方埃的表面，例如，環肽CXCR4拮抗劑CVX15(Wu等人(2007),Science330,1066-71)、結合整合素αVb3的具有Arg-Gly-Asp基序的環肽(Xiong等人(2002),Science296(5565),151-5)、或結合尿激酶型纖溶酶原激活物的環肽抑制劑upain-1(Zhao等人(2007)JStructBiol160(1),1-10)。由于其環狀構型，大環肽比線性肽柔性低，導致了在結合靶標時熵損失較少，且得到了較高的結合親和性。降低的柔性還導致鎖定靶標特異性構象，與線性肽相比增加了結合特異性。該效果已經被基質金屬蛋白酶8(MMP-8)有效的選擇性抑制劑例證了，其中當其>環打開時，失去了對其它MMP的選擇性(Cherney等人(1998),JMedChem41(11),1749-51)。通過大環化實現的有利的結合特性，甚至在具有一個以上肽環的多環肽中更顯著，例如，在萬古霉素、乳酸鏈球菌肽或放線菌素中。先前不同的研究小組將帶有半胱氨酸殘基的多肽連接至合成的分子結構上(Kemp和McNamara(1985),J.Org.Chem；Timmerman等人(2005),ChemBioChem)。Meloen和同事使用三(溴甲基)苯和相關分子將多個肽環快速且定量地環化至合成的支架上，用于蛋白表面的結構化模擬(Timmerman等人(2005),ChemBioChem)。生成候選藥物化合物的方法公開于WO2004/077062和WO2006/078161中，其中通過將含有半胱氨酸的多肽連接至例如三(溴甲基)苯的分子支架生成所述化合物。已開發了基于噬菌體展示的組合方法，用于產生和篩選感興趣的靶標的雙環肽的大文庫(Heinis等人(2009),NatChemBiol5(7),502-7和WO2009/098450)。簡言之，含三個半胱氨酸殘基和兩個區域的六個隨機氨基酸(Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)(SEQIDNO:97)的線性肽組合文庫在噬菌體上展示，并通過半胱氨酸側鏈共價連接至小分子(三(溴甲基)苯)進行環化。在對人蛋白酶組織蛋白酶G和血漿激肽釋放酶(PK)的親和性選擇中分離的雙環肽證實為納摩爾級的抑制常數。WO2013/050615和WO2013/050616進一步公開了特異于人血漿激肽釋放酶的雙環肽配體。
技術實現思路
根據本專利技術的第一方面，提供了一種特異于血漿激肽釋放酶的肽配體，其包含多肽，所述多肽包含被至少兩個環序列分隔的至少三個半胱氨酸殘基，以及分子支架，所述分子支架與多肽的半胱氨酸殘基形成共價鍵，從而在分子支架上形成至少兩個多肽環，其中所述肽配體包含選自以下任意的肽序列：(a)-Ci-N-X-W-N-P-W-Cii-O/U-X-X-X-O/J-X-Ciii-(SEQIDNO:1)；(b)-Ci-B-N-J-W-N-P-Cii-X-L-O-X-X-X-Ciii-(SEQIDNO:2)；(c)-Ci-Q-K-F-E-S-R-Cii-X-X-X-X-X-X-Ciii-(SEQIDNO:3)；(d)-Ci-P-L-S-D-T-L-Cii-Y-R-R-M-P-P-Ciii-(SEQIDNO:4)；(e)-Ci-P-Y-P-F-R-Cii-X-H-X-X-X-Ciii-(SEQIDNO:5)；和(f)-Ci-(N)a-U-J-P-J-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii-(SEQIDNO:6)；或其經修飾的衍生物，或藥學可接受的鹽；其中：Ci、Cii和Ciii分別代表第一、第二和第三半胱氨酸殘基；下標“a”代表選自0或1的整數；X代表任意氨基酸殘基；O代表非極性的脂肪族氨基酸殘基，選自G、A、I、L、P和V；J代表非極性的芳香族氨基酸殘基，選自F、W和Y；U代表極性的不帶電的氨基酸殘基，選自N、C、Q、M、S和T；以及B代表極性的帶正電的氨基酸殘基，選自R、H和K。根據如文中實施例中描述的生物選擇，鑒定本專利技術的新的結合激肽釋放酶的雙環肽配體。在生物選擇期間，在人和大鼠激肽釋放酶間轉換靶標誘餌，鑒定具有物種間良好的交叉反應性的前導序列。為增強形成雙環肽前導物的能力，在分子上引入增溶修飾，并且大鼠藥代動力學分析顯示在體內序列具有高代謝穩定性。根據本專利技術的其它方面，提供了一種藥物組合物，其包含如文中定義的肽配體，所述肽配體與一種或更多種藥學可接受的賦形劑組合。根據本專利技術的其它方面，提供了一種如文中定義的肽配體在預防、抑制或治療炎癥狀態、變應性超敏反應、癌癥、細菌或病毒感染和自體免疫性疾病中的用途。附圖說明圖1：相對于交叉反應性的新型結合激肽釋放酶的雙環前導而言，06-34-18對照的比較性大鼠血漿穩定性。圖2：相對于交叉反應性的新型結合激肽釋放酶的雙環前導而言，06-34-18對照的比較性人血漿穩定性。圖3：衍生物06-550在人(A)和大鼠(B)血漿中的比較性穩定性。在0(高)、21(中)和46(低)小時取樣血漿和肽的混合物。肽的母體峰在2481.9MH+。隨著46小時的時間進程觀察到很少的降解，母體峰保持高的相對豐度。圖4：在大鼠中兩個選擇的肽的體內藥代動力學譜。特別地，衍生物06-259-02在大鼠循環中顯示顯著的穩定性，其清除主要通過腎濾過驅動。圖5：在兔的玻璃體內注射兩種選擇的肽后體內藥代動力學分析。包括衍生物06-550的兩種肽從玻璃狀液中被緩慢地清除，具有20-30小時的清除半衰期。圖6：兩種選擇的肽對角叉菜膠誘導的足腫脹的作用。在所有時間點，包括衍生物06-259-02的兩種肽均抑制由角叉菜膠誘導的足腫脹。具體實施方式除非另有定義，所有用于文中的技術和科學術語具有與本領域技術人員通常理解的相同含義，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種特異于血漿激肽釋放酶的肽配體，其包含多肽，所述多肽包含被至少兩個環序列分隔的至少三個半胱氨酸殘基，以及分子支架，所述分子支架與多肽的半胱氨酸殘基形成共價鍵，從而在分子支架上形成至少兩個多肽環，其中所述肽配體包含選自以下任意的肽序列：(a)?Ci?N?X?W?N?P?W?Cii?O/U?X?X?X?O/J?X?Ciii?(SEQ?ID?NO:1)；(b)?Ci?B?N?J?W?N?P?Cii?X?L?O?X?X?X?Ciii?(SEQ?ID?NO:2)；(c)?Ci?Q?K?F?E?S?R?Cii?X?X?X?X?X?X?Ciii?(SEQ?ID?NO:3)；(d)?Ci?P?L?S?D?T?L?Cii?Y?R?R?M?P?P?Ciii?(SEQ?ID?NO:4)；(e)?Ci?P?Y?P?F?R?Cii?X?H?X?X?X?Ciii?(SEQ?ID?NO:5)；和(f)?Ci?(N)a?U?J?P?J?R?Cii?V?Y?Y?P?D?I?Ciii?(SEQ?ID?NO:6)；或其經修飾的衍生物，或藥學可接受的鹽；其中：Ci、Cii和Ciii分別代表第一、第二和第三半胱氨酸殘基；下標“a”代表選自0或1的整數；X代表任意氨基酸殘基；O代表非極性的脂肪族氨基酸殘基，選自G、A、I、L、P和V；J代表非極性的芳香族氨基酸殘基，選自F、W和Y；U代表極性的不帶電的氨基酸殘基，選自N、C、Q、M、S和T；以及B代表極性的帶正電的氨基酸殘基，選自R、H和K。...

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.10.28 GB 1318941.0;2014.06.10 GB 1410265.11.一種特異于血漿激肽釋放酶的肽配體，其包含多肽，所述多肽包含被至少兩個環序
列分隔的至少三個半胱氨酸殘基，以及分子支架，所述分子支架與多肽的半胱氨酸殘基形
成共價鍵，從而在分子支架上形成至少兩個多肽環，其中所述肽配體包含選自以下任意的
肽序列：
(a)-Ci-N-X-W-N-P-W-Cii-O/U-X-X-X-O/J-X-Ciii-(SEQIDNO:1)；
(b)-Ci-B-N-J-W-N-P-Cii-X-L-O-X-X-X-Ciii-(SEQIDNO:2)；
(c)-Ci-Q-K-F-E-S-R-Cii-X-X-X-X-X-X-Ciii-(SEQIDNO:3)；
(d)-Ci-P-L-S-D-T-L-Cii-Y-R-R-M-P-P-Ciii-(SEQIDNO:4)；
(e)-Ci-P-Y-P-F-R-Cii-X-H-X-X-X-Ciii-(SEQIDNO:5)；和
(f)-Ci-(N)a-U-J-P-J-R-Cii-V-Y-Y-P-D-I-Ciii-(SEQIDNO:6)；
或其經修飾的衍生物，或藥學可接受的鹽；
其中：
Ci、Cii和Ciii分別代表第一、第二和第三半胱氨酸殘基；
下標“a”代表選自0或1的整數；
X代表任意氨基酸殘基；
O代表非極性的脂肪族氨基酸殘基，選自G、A、I、L、P和V；
J代表非極性的芳香族氨基酸殘基，選自F、W和Y；
U代表極性的不帶電的氨基酸殘基，選自N、C、Q、M、S和T；以及
B代表極性的帶正電的氨基酸殘基，選自R、H和K。
2.根據權利要求1所述的肽配體，其包含式(a)的序列。
3.根據權利要求1或2所述的肽配體，其中式(a)的肽包含選自-Ci-N-X-W-N-P-W-Cii-O/
U-X-X-X-O-X-Ciii-(SEQIDNO:7)的序列，例如-Ci-N-T/H/Y-W-N-P-W-Cii-G/S/P-A/V/W/D/
S-D/E/V/T/P-A/G/P/I/R/D-G/P/Y/I-F/I/L/V/R/G/D-Ciii-(SEQIDNO:8)，特別地，-Ci-N-
T/H/Y-W-N-P-W-Cii-G/S/P-A/V/W-D/E/V-A/G/P-G/P-F/I/L/V-Ciii-(SEQIDNO:9)。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的肽配體，其中式(a)的肽包含選自以下的序列：
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-G-W-V-G-G-F-Ciii-(06-259)(SEQIDNO:10)；
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-V-E-P-P-V-Ciii-(06-259-01)(SEQIDNO:11)；
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii-(06-259-02)(SEQIDNO:12)；
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-A-D-P-P-I-Ciii-(06-259-03)(SEQIDNO:13)；
-Ci-N-Y-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii-(06-259-04)(SEQIDNO:14)；
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-A-D-P-P-R-Ciii-(06-259-F1)(SEQIDNO:15)；
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-P-A-D-I-P-V-Ciii-(06-259-E2)(SEQIDNO:16)；
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-D-D-P-Y-I-Ciii-(06-259-H3)(SEQIDNO:17)；
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-S-D-P-P-V-Ciii-(06-259-H4)(SEQIDNO:18)；
-Ci-N-Y-W-N-P-W-Cii-S-D-T-R-I-G-Ciii-(06-259-A6)(SEQIDNO:19)；和
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-S-W-P-D-I-D-Ciii-(06-259-F2)(SEQIDNO:20)；
例如-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-V-E-P-P-V-Ciii-(06-259-01)(SEQIDNO:11)；
-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii-(06-259-02)(SEQIDNO:12)；
-Ci-N-H-W-N-P-W-Cii-S-A-D-P-P-I-Ciii-(06-259-03)(SEQIDNO:13)；和
-Ci-N-Y-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii-(06-259-04)(SEQIDNO:14)；
特別地，-Ci-N-T-W-N-P-W-Cii-P-W-D-A-P-L-Ciii-(06-259-02)(SEQIDNO:12)。
5.根據權利要求1所述的肽配體，其包含式(b)的序列。
6.根據權利要求1或5所述的肽配體，其中式(b)的肽包含選自-Ci-K/R-N-Y-W-N-P-Cii-
D/T/G-L-I/V/L-E/M/N/P/T/Q/S/Y/G/D/W/R/H/A-D/G/I/T/A/S/P/V-P/S/T/A/K/G/H/F/Q/
D/L/I/M/R/Y-Ciii-(SEQIDNO:21)的序列，例如-Ci-K/R-N-Y-W-N-P-Cii-D/T-L-I/V-E/M/
N/P/T-D/G/I/T-P/S/T-Ciii-(SEQIDNO:22)。
7.根據權利要求5或6所述的肽配體，其中式(b)的肽包含選自以下的序列：
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-T-I-S-Ciii-(06-254)(SEQIDNO:23)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-E-T-T-Ciii-(06-254-01)(SEQIDNO:24)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-G-P-Ciii-(06-254-02)(SEQIDNO:25)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-M-D-T-Ciii-(06-254-03)(SEQIDNO:26)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-Q-D-A-Ciii-(06-254-F4)(SEQIDNO:27)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-S-I-K-Ciii-(06-254-B3)(SEQIDNO:28)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-T-G-Ciii-(06-254-G3)(SEQIDNO:29)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-Q-I-H-Ciii-(06-254-H4)(SEQIDNO:30)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-G-I-T-Ciii-(06-254-G2)(SEQIDNO:31)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-D-T-F-Ciii-(06-254-A4)(SEQIDNO:32)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-E-A-Q-Ciii-(06-254-G4)(SEQIDNO:33)；
-Ci-K-N-F-W-N-P-Cii-D-L-I-P-I-S-Ciii-(06-254-D3)(SEQIDNO:34)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-W-T-D-Ciii-(06-254-E2)(SEQIDNO:35)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-D-L-Ciii-(06-254-F5)(SEQIDNO:36)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-E-S-T-Ciii-(06-254-E5)(SEQIDNO:37)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-R-P-P-Ciii-(06-254-D1)(SEQIDNO:38)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-G-I-A-Ciii-(06-254-B9)(SEQIDNO:39)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-V-H-D-I-Ciii-(06-254-E3)(SEQIDNO:40)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-P-D-M-Ciii-(06-254-D6)(SEQIDNO:41)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-I-A-D-L-Ciii-(06-254-H3)(SEQIDNO:42)；
-Ci-K-N-Y-W-N-P-Cii-D-L-L-H-V-R-Ciii-(06-254-A7)(SEQIDNO:43)；

【專利技術屬性】
技術研發人員：D·托伊費爾，C·斯塔切，E·沃克，
申請(專利權)人：拜斯科醫療有限公司，
類型：發明
國別省市：英國;GB