一種基于氮摻雜二氧化鈦納米片的電致化學發光雙酚A生物傳感器的制備方法及應用技術

本發明專利技術公開了一種基于氮摻雜二氧化鈦納米片的電致化學發光雙酚A生物傳感器的制備方法。屬于新型納米功能材料與生物傳感器技術領域。本發明專利技術首先制備了一種新型片狀的磁性納米光敏材料FeMn?N@TiO2，利用該材料的良好的生物相容性、大的比表面積和鐵磁性，負載上雙酚A抗體，然后通過戊二醛的交聯作用辣根過氧化物酶，在進行檢測時，由于辣根過氧化物酶可以催化過氧化氫原位產生氧氣，并進而為與底液進行電化學反應，產生高而穩定的電致化學發光信號，再利用抗體與抗原的特異性定量結合對電子傳輸能力的影響，使得電致化學發光信號相應降低，最終制得了成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速、制備簡單的檢測雙酚A的電致化學發光生物傳感器。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種電致化學發光雙酚A生物傳感器的制備方法。屬于新型納米功能材料與生物傳感器

技術介紹
環境雌激素是指一類進入機體后，具有干擾體內正常內分泌物質的合成、釋放、運輸、結合、代謝等過程，激活或抑制內分泌系統的功能，從而破壞維持機體穩定性和調控作用的化合物，環境雌激素種類繁多，包括人工合成化合物及植物天然雌激素，廣泛分布于自然界中。雙酚A便是一種類雙酚類合成雌激素。目前，檢測雙酚A的方法主要有色譜法、質譜法等。此類方法儀器貴重、操作復雜，化驗人員需要專業培訓后才能進行檢測。因此，研發成本低、檢測快、靈敏度高、特異性強的雙酚A傳感器具有重要意義。電致化學發光傳感器由于其靈敏度高、特異性好、操作簡便等優點被廣泛應用于臨床診斷、藥物分析、環境監測等領域。制備性能優越的電化學發光傳感器，其最關鍵技術就是發光強度及穩定性和免疫分子的有效固定及重現性等性能的提高。二氧化鈦是應用最為廣泛的一種光催化劑材料，由于片狀二氧化鈦納米材料能夠暴露更多的高指數晶面，具有更高的光催化活性，二氧化鈦納米片具有比納米粒子更好地應用前景，對于二氧化鈦納米片的研究也備受關注。同時，二氧化鈦導電性差也限制了由單一二氧化鈦納米材料構建的電致化學發光傳感器的靈敏度普遍不高，不利于實際應用。但是，在半導體納米材料上修飾或復合特殊的納米材料，可以有效提高半導體表面的共振能量轉移，產生更強的發光強度，并大大提高檢測靈敏度。因此，設計、制備高效、穩定的二氧化鈦納米片及其修飾物是制備電致化學發光傳感器的關鍵技術。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種制備簡單、靈敏度高、檢測快速、特異性強的電致化學發光雙酚A生物傳感器的制備方法，所制備的傳感器，可用于雙酚A的快速、靈敏檢測?；诖四康?，本專利技術首先制備了一種二維片狀的磁性納米材料，即鐵和錳雙金屬原位復合的氮摻雜二氧化鈦納米片FeMn-NTiO2，利用該材料的良好的生物相容性、大的比表面積和鐵磁性，負載上雙酚A抗體，然后通過戊二醛的交聯作用固定辣根過氧化物酶，在進行檢測時，由于辣根過氧化物酶可以催化過氧化氫原位生成O2，并與底液中的K2S2O8進行電化學反應，產生電致化學發光信號，再利用抗體與抗原的特異性定量結合對電子傳輸能力的影響，使得電流強度降低，從而降低發光強度，最終實現了采用無標記的電致化學發光方法檢測雙酚A的生物傳感器的構建。本專利技術采用的技術方案如下：1.一種基于氮摻雜二氧化鈦納米片的電致化學發光雙酚A生物傳感器的制備方法，所述的氮摻雜二氧化鈦納米片為鐵和錳雙金屬原位復合的氮摻雜二氧化鈦納米片FeMn-NTiO2；所述的電致化學發光雙酚A生物傳感器由工作電極、FeMn-NTiO2、雙酚A抗體、牛血清白蛋白、戊二醛、辣根過氧化物酶組成；其特征在于，所述的制備方法包括以下制備步驟：a.FeMn-NTiO2的制備；b.電致化學發光雙酚A生物傳感器的制備；其中，步驟a制備FeMn-NTiO2的具體步驟為：首先，取0.8mmol鐵鹽、0.8~1.2mmol錳鹽和1mmol銨鹽加入到5mL鈦酸四丁酯中，攪拌過程中，緩慢加入0.5~0.8mL氫氟酸，160~200℃下在反應釜中反應18~24小時，冷卻至室溫后，用超純水和無水乙醇離心洗滌三次后，50℃下真空干燥；然后，將研磨的粉末放入馬弗爐中，升溫速度為1~3℃/min，480~560℃下在氮氣保護下，煅燒10~60min；最后，將煅燒后的粉末冷卻至室溫，即制得FeMn-NTiO2；所述的鐵鹽選自下列之一：硫酸鐵、氯化鐵、硝酸鐵；所述的錳鹽選自下列之一：硫酸錳、氯化錳、硝酸錳；所述的銨鹽選自下列之一：硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、碳酸銨；步驟b制備電致化學發光雙酚A生物傳感器的具體步驟為：（1）以ITO導電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂8~12μL的FeMn-NTiO2溶膠，室溫下晾干；（2）將步驟（1）中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續在電極表面滴涂8~12μL10μg/mL的雙酚A抗體溶液，4℃冰箱中保存晾干；（3）將步驟（2）中得到的電極用PBS清洗，繼續在電極表面滴涂8~12μL濃度為100μg/mL的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中保存晾干；（4）將步驟（3）中得到的電極用PBS清洗，繼續在電極表面滴涂2~4μL的戊二醛溶液，4℃冰箱中保存晾干；（5）將步驟（4）中得到的電極用PBS清洗，繼續在電極表面滴涂6~10μL濃度為20μg/mL的辣根過氧化物酶溶液，4℃冰箱中保存晾干；（6）將步驟（5）中得到的電極用PBS清洗，在4℃冰箱中保存晾干后，即制得電致化學發光雙酚A生物傳感器；所述的FeMn-NTiO2溶液為將50mg的FeMn-NTiO2粉末溶于10mL超純水中，并超聲30min后制得的水溶膠；所述的PBS為10mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4；所述的戊二醛溶液為體積比為2.5%的戊二醛水溶液。2.如權利要求1所述的制備方法所制備的電致化學發光雙酚A生物傳感器的應用，其特征在于，包括如下應用步驟：a.標準溶液配制：配制一組包括空白標樣在內的不同濃度的雙酚A標準溶液；b.工作電極修飾：將如權利要求1所述的制備方法所制備的電致化學發光雙酚A生物傳感器為工作電極，將步驟a中配制的不同濃度的雙酚A標準溶液分別滴涂到工作電極表面，4℃冰箱中保存；c.工作曲線繪制：將Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極，與步驟b所修飾好的工作電極組成三電極系統，連接到電致化學發光檢測設備上；在電解槽中先后加入15mL的K2S2O8溶液和100μL的H2O2溶液；用循環伏安法對組裝的工作電極施加循環電壓；根據所得的電致化學發光的光信號強度與雙酚A抗原標準溶液濃度之間的關系，繪制工作曲線；空白標樣的光信號強度記為D0，含有不同濃度的雙酚A標準溶液的光信號強度記為Di，響應光信號強度降低的差值為ΔD=D0-Di，ΔD與雙酚A標準溶液的質量濃度C之間成線性關系，繪制ΔD－C工作曲線；d.雙酚A的檢測：用待測樣品代替步驟a中的雙酚A標準溶液，按照步驟b和c中的方法進行檢測，根據響應光信號強度降低的差值ΔD和工作曲線，得到待測樣品中雙酚A的含量；所述的K2S2O8溶液由1molK2S2O8和1molKCl溶于10L的pH=6.5緩沖溶液中制備得到，所述的pH=6.5緩沖溶液為pH值為6.5的磷酸鹽緩沖溶液；所述的H2O2溶液為過氧化氫水溶液，所述的過氧化氫水溶液的濃度為10%。本專利技術的有益成果（1）本專利技術所述的電致化學發光雙酚A生物傳感器制備簡單，操作方便，實現了對樣品的快速、靈敏、高選擇性檢測，并且成本低，可應用于便攜式檢測，具有市場發展前景；（2）本專利技術首次制備了新型二維片狀光敏材料FeMn-NTiO2，由于鐵、錳在二氧化鈦納米片上的原位生長而充分與二氧化鈦納米片接觸，利用鐵、錳的金屬表面等離子體作用以及二者的相互促本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于氮摻雜二氧化鈦納米片的電致化學發光雙酚A生物傳感器的制備方法，所述的氮摻雜二氧化鈦納米片為鐵和錳雙金屬原位復合的氮摻雜二氧化鈦納米片FeMn?N@TiO2；所述的電致化學發光雙酚A生物傳感器由工作電極、FeMn?N@TiO2、雙酚A抗體、牛血清白蛋白、戊二醛、辣根過氧化物酶組成；?其特征在于，所述的制備方法包括以下制備步驟：a.?FeMn?N@TiO2的制備；b.?電致化學發光雙酚A生物傳感器的制備；其中，步驟a制備FeMn?N@TiO2的具體步驟為：首先，取0.8?mmol鐵鹽、0.8~1.2?mmol錳鹽和1?mmol銨鹽加入到5?mL鈦酸四丁酯中，攪拌過程中，緩慢加入0.5~0.8?mL氫氟酸，160~200?℃下在反應釜中反應18~24小時，冷卻至室溫后，用超純水和無水乙醇離心洗滌三次后，50℃下真空干燥；然后，將研磨的粉末放入馬弗爐中，升溫速度為1~3?℃/min，480~560℃下在氮氣保護下，煅燒10~60?min；最后，將煅燒后的粉末冷卻至室溫，即制得FeMn?N@TiO2；所述的鐵鹽選自下列之一：硫酸鐵、氯化鐵、硝酸鐵；所述的錳鹽選自下列之一：硫酸錳、氯化錳、硝酸錳；所述的銨鹽選自下列之一：硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、碳酸銨；步驟b制備電致化學發光雙酚A生物傳感器的具體步驟為：（1）以ITO導電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂8~12?μL的FeMn?N@TiO2溶膠，室溫下晾干；（2）將步驟（1）中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續在電極表面滴涂8~12?μL?10?μg/mL的雙酚A抗體溶液，4?℃?冰箱中保存晾干；（3）將步驟（2）中得到的電極用PBS清洗，繼續在電極表面滴涂8~12?μL?濃度為100?μg/mL的牛血清白蛋白溶液，4?℃?冰箱中保存晾干；（4）將步驟（3）中得到的電極用PBS清洗，繼續在電極表面滴涂2~4?μL?的戊二醛溶液，4?℃?冰箱中保存晾干；（5）將步驟（4）中得到的電極用PBS清洗，繼續在電極表面滴涂6~10?μL?濃度為20μg/mL的辣根過氧化物酶溶液，4?℃?冰箱中保存晾干；（6）將步驟（5）中得到的電極用PBS清洗，在4?℃?冰箱中保存晾干后，即制得電致化學發光雙酚A生物傳感器；所述的FeMn?N@TiO2溶液為將50?mg?的FeMn?N@TiO2粉末溶于10?mL超純水中，并超聲30?min后制得的水溶膠；所述的PBS為10mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4；所述的戊二醛溶液為體積比為2.5%的戊二醛水溶液。...

【技術特征摘要】
1.一種基于氮摻雜二氧化鈦納米片的電致化學發光雙酚A生物傳感器的制備方法，所述的氮摻雜二氧化鈦納米片為鐵和錳雙金屬原位復合的氮摻雜二氧化鈦納米片FeMn-NTiO2；所述的電致化學發光雙酚A生物傳感器由工作電極、FeMn-NTiO2、雙酚A抗體、牛血清白蛋白、戊二醛、辣根過氧化物酶組成；
其特征在于，所述的制備方法包括以下制備步驟：
a.FeMn-NTiO2的制備；
b.電致化學發光雙酚A生物傳感器的制備；
其中，步驟a制備FeMn-NTiO2的具體步驟為：
首先，取0.8mmol鐵鹽、0.8~1.2mmol錳鹽和1mmol銨鹽加入到5mL鈦酸四丁酯中，攪拌過程中，緩慢加入0.5~0.8mL氫氟酸，160~200℃下在反應釜中反應18~24小時，冷卻至室溫后，用超純水和無水乙醇離心洗滌三次后，50℃下真空干燥；然后，將研磨的粉末放入馬弗爐中，升溫速度為1~3℃/min，480~560℃下在氮氣保護下，煅燒10~60min；最后，將煅燒后的粉末冷卻至室溫，即制得FeMn-NTiO2；
所述的鐵鹽選自下列之一：硫酸鐵、氯化鐵、硝酸鐵；
所述的錳鹽選自下列之一：硫酸錳、氯化錳、硝酸錳；
所述的銨鹽選自下列之一：硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、碳酸銨；
步驟b制備電致化學發光雙酚A生物傳感器的具體步驟為：
（1）以ITO導電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂8~12μL的FeMn-NTiO2溶膠，室溫下晾干；
（2）將步驟（1）中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續在電極表面滴涂8~12μL10μg/mL的雙酚A抗體溶液，4℃冰箱中保存晾干；
（3）將步驟（2）中得到的電極用PBS清洗，繼續在電極表面滴涂8~12μL濃度為100μg/mL的牛血清白蛋白溶液，4℃冰箱中保存晾干；
（4）將步驟（3）中得到的電極用PBS清洗，繼續在電極表面滴涂2~4μL的戊二醛溶液，4℃冰箱中保存晾干；
（5）將步驟（4）中得到的電極用PBS清洗，繼續在電極表面滴涂6~10μL濃度為20μg/mL的辣根過...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張勇，吳丹，王耀光，范大偉，魏琴，
申請(專利權)人：濟南大學，
類型：發明
國別省市：山東;37