血管內皮鈣黏蛋白抗原表位、抗體及其應用制造技術

本發明專利技術涉及分子生物學及免疫學技術領域，尤其涉及血管內皮鈣黏蛋白抗原表位、抗體及其應用。本發明專利技術提供了血管內皮鈣黏蛋白抗原表位、抗體及其應用。該抗原表位氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，位于CDH5蛋白的N端，具有更高的保守性。本發明專利技術提供的表位是中和性表位，能夠特異性的識別腫瘤血管并抑制其生成。本發明專利技術通過試驗證實，該表位能夠特異性識別腫瘤血管中的血管內皮鈣黏蛋白，從而起到抑制腫瘤血管生成的作用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分子生物學及免疫學
，尤其涉及血管內皮鈣黏蛋白抗原表位、抗體及其應用。
技術介紹
腫瘤血管是異常增生的血管。與正常血管相比，無論在結構還是功能方面都有很多差異。腫瘤新生血管分布不規則，血管擴張，管壁薄且有較少周細胞覆蓋。腫瘤新生血管內皮不連續，有腫瘤細胞嵌入血管內皮形成馬賽克結構，盡管異常彎曲的腫瘤血管通透性增加，但是運送氧氣和營養物質的效率很低。由于腫瘤微環境的變化，血管內皮和基質細胞過度分泌和表達(或缺失)一些蛋白質分子，這些分子將成為腫瘤新生血管的標志分子。另外，細胞表面的膜受體所誘發的細胞信號通路也將成為重要的新靶標分子。因此，腫瘤血管靶向治療成為腫瘤治療的策略之一。血管內皮鈣黏蛋白(vascularendothelialcadherin，VE-cadherin),以下稱為CDH5，是血管內皮細胞表面特異性表達的一種跨膜黏附蛋白，介導相鄰內皮細胞之間的黏附，在保持血管完整性、調節內皮細胞間通透性、白細胞外滲以及細胞內信號轉導中發揮著重要作用。除黏附特性外，CDH5還參與調節各種細胞內進程，如細胞增殖、細胞凋亡以及調節血管內皮生長因子受體的功能。CDH5屬于Ⅱ型鈣黏蛋白，分子量約為130kDa～140kDa，是由780個氨基酸組成的單鏈糖蛋白，由胞外區，跨膜區和胞漿區三部分組成。胞外區含110個氨基酸，由5個同源重復結構域和Ca2+結合序列組成，可介導鈣依賴的細胞與細胞黏附，胞漿區通過胞內介導蛋白與細胞骨架相連。內皮細胞的完整性得以維持歸功于細胞表面的粘附功能，如CDH5及其與相關細胞骨架相互作用的能力。這些相互作用的破壞將導致血漿成分滲漏進入周圍組織，導致水腫。抗原表位(epitope)是抗原分子中識別、結合抗體的基礎，因此是檢測抗體的實際有效組分。研究表明，根據識別的表位，CDH5抗體可能會破壞血管內皮細胞間的相互作用。但是，現有的CDH5抗體由于表位不恰當等原因，在識別腫瘤血管的同時還會識別一部分正常的血管，如此便不能夠特異性的與腫瘤血管結合并形成抑制作用。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術要解決的技術問題在于提供血管內皮鈣黏蛋白抗原表位、抗體及其應用。本專利技術提供的表位是中和性表位，能夠特異性的識別腫瘤血管并抑制其生成。血管內皮鈣黏蛋白抗原表位，該抗原表位氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本專利技術提供的血管內皮鈣黏蛋白抗原表位的氨基酸序列為LDREVTPWYNLTVEA，位于CDH5蛋白的N端，具有更高的保守性。雖然，目前抗原表位可以利用生物信息學軟件來預測，然而，越來越多的研究表明，軟件預測抗原表位的錯誤概率較高，且軟件對抗原表位的預測只針對目的抗原蛋白的全長，真正應用的過程中往往存在著特異性的問題，需要實驗證實。而本專利技術通過試驗證實，該表位能夠特異性識別腫瘤血管中的血管內皮鈣黏蛋白，從而起到抑制腫瘤血管生成的作用。本專利技術還提供了編碼SEQIDNO:1所示氨基酸序列的DNA分子。在本專利技術的實施例中，編碼SEQIDNO:1所示氨基酸序列的DNA分子具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，或與SEQIDNO:2具有90％以上同源性，且能夠表達SEQIDNO:1所示氨基酸序列。本專利技術提供的編碼SEQIDNO:1所示氨基酸序列的DNA分子，具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。SEQIDNO:2所示核苷酸序列的DNA分子能夠準確、高效編碼SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。本專利技術還提供了一種表達質粒，包括如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列和pET41a載體。pET41a載體是用來克隆和高水平表達蛋白質的載體，載體融合表達一個含有220個氨基酸的GST標簽蛋白純化片段。本專利技術將SEQIDNO:2所示的核苷酸序列構建入pET41a載體，使本專利技術提供的表位能夠在大腸桿菌中穩定高效的表達，并且經組裝該表位能夠暴露于融合蛋白表面。本專利技術還提供了一種重組表達載體，由本專利技術提供的表達質粒轉化大腸桿菌TOP10制得。大腸桿菌TOP10適用于高效的DNA克隆和質粒擴增，能保證高拷貝質粒的穩定遺傳。將本專利技術提供的表達質粒轉化大腸桿菌TOP10后，經IPTG誘導能夠穩定、高效的表達出大量的融合蛋白。本專利技術還要求保護本專利技術提供的重組表達載體表達的融合蛋白。本專利技術提供的融合蛋白的制備方法為，將本專利技術提供的重組表達載體以LB培養基培養，經IPTG誘導獲得融合蛋白。IPTG誘導的濃度為1mmol/L，溫度為37℃，時間為4小時。實驗表明，采用本專利技術提供的方法誘導獲得的融合蛋白的濃度為1mg/ml。本專利技術提供的融合蛋白能夠引起小鼠的免疫反應，產生特異性抗體。本專利技術提供了一種單克隆抗體，由保藏編號為CCTCCNO.C201581的雜交瘤細胞株產生。本專利技術提供的單克隆抗體的制備方法包括以下步驟：步驟1：本專利技術提供的融合蛋白免疫BALB/C小鼠后，取小鼠脾細胞；步驟2：小鼠脾細胞與Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞融合，經HAT培養，篩選陽性細胞株，經體內誘生或體外培養，制得本專利技術提供的單克隆抗體。在本專利技術的實施例中，步驟1中免疫的時間為3個月。在本專利技術的實施例中，HAT培養的時間為7～10天。在本專利技術的實施例中，步驟2中融合的融合劑為PEG1500。在本專利技術的實施例中，經體內誘生制得本專利技術提供的單克隆抗體。在一些實施例中，體內誘生的陽性細胞株細胞個數為2×106個～4×106個。在本專利技術的實施例中，體內誘生后經ProteinG親和層析純化制得本專利技術提供的單克隆抗體。經檢測，采用本專利技術提供的方法制得的單克隆抗體的濃度為0.35mg/ml，效價為1:10000。本專利技術還提供了血管內皮鈣黏蛋白檢測試劑盒，包括蛋白和抗體；蛋白為SEQIDNO：1所示氨基酸序列的多肽或如權利要求5所述的融合蛋白；抗體由保藏編號為CCTCCNO.C201581的雜交瘤細胞株產生。實驗表明，經ELISA檢測，本專利技術提供的抗體能夠特異性的識別CDH5蛋白溶液；經流式細胞檢測，本專利技術提供的抗體能夠特異性的識別EA.hy926細胞中的CDH5蛋白；經Westernblot檢測，本專利技術提供的抗體能夠特異性的識別EA.hy926細胞中的CDH5蛋白；經免疫熒光和免疫組化檢測，本專利技術提供的抗體能夠特異性的識別EA.hy926細胞中的CDH5蛋白。本專利技術提供的試劑盒能夠準確快速的檢測血管內皮鈣黏蛋白。其中的抗體和蛋白能夠彼此識別，呈現很高的結合反應。作為優選，本專利技術提供的試本文檔來自技高網...

【技術保護點】
血管內皮鈣黏蛋白抗原表位，其特征在于，該抗原表位氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

【技術特征摘要】
1.血管內皮鈣黏蛋白抗原表位，其特征在于，該抗原表位氨基酸序列如SEQIDNO:1所
示。
2.編碼SEQIDNO:1所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，其具有如SEQIDNO:2所
示的核苷酸序列，或與SEQIDNO:2具有90％以上同源性且能夠表達SEQIDNO:1所示氨基
酸序列。
3.一種表達質粒，其特征在于，包括如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列和pET41a載體。
4.一種重組表達載體，其特征在于，由權利要求3所述的表達質粒轉化大腸桿菌TOP10
制得。
5.由權利要求4所述重組表達載體表達的融合蛋白。
6.一種單克隆抗體，由保藏編號為CCTCCNO.C201581的雜交瘤細胞株產生。
7.如權利要求6所述單克隆抗體的制...

【專利技術屬性】
技術研發人員：何楊，丁潔，楊劍峰，
申請(專利權)人：蘇州大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32