本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種木糖還原酶突變體、基因工程菌及在生產(chǎn)木糖醇中的應(yīng)用。所述木糖還原酶突變體，氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明專利技術(shù)對木糖還原酶進(jìn)行了8個氨基酸位點的突變，降低了其催化阿拉伯糖為阿拉伯糖醇的活性，提高了其轉(zhuǎn)化木糖醇的選擇性，生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中副產(chǎn)物阿拉伯糖醇已經(jīng)檢測不到，本發(fā)明專利技術(shù)可使生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇下游的分離步驟簡化，降低生產(chǎn)成本，提高木糖醇產(chǎn)品的純度。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及基因工程和生物
，尤其涉及一種木糖還原酶突變體、基因工程菌及在生產(chǎn)木糖醇中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
玉米芯半纖維素水解液是目前國內(nèi)生產(chǎn)木糖醇的主要原料，其除主要成分木糖外，還含有葡萄糖、阿拉伯糖等其它成分。在木糖醇的工業(yè)化生產(chǎn)中，鎳催化加氫時，其對半纖維素水解液中各種糖沒有選擇性，在催化木糖還原生產(chǎn)木糖醇時也會催化其它糖類生成相應(yīng)的糖醇，影響了木糖醇的產(chǎn)品質(zhì)量。所以，在進(jìn)行化學(xué)催化之前，需要對半纖維素水解液中的木糖進(jìn)行分離和純化，盡可能除去水解液中的雜糖，這就需要額外的分離步驟，無疑增加了生產(chǎn)成本。作為水解液中含量僅次于木糖的阿拉伯糖，是木糖的同分異構(gòu)體，與木糖的分離難度大，導(dǎo)致鎳催化后產(chǎn)物中有阿拉伯糖醇的存在，而木糖醇中阿拉伯糖醇的去除更加困難，所以使用化學(xué)催化獲得高純度的木糖醇較為困難，成本較高。目前市場上高純度的木糖醇的價格往往是普通木糖醇價格的幾倍到十幾倍(RavellaSR,GallagherJ,FishS,etal.Overviewoncommercialproductionofxylitol,economicanalysisandmarkettrends[M].D-xylitol.Springer.2012:291-306.)，因此提高木糖醇的純度對提高其附加值有著重要的現(xiàn)實意義。目前雖然有報道酵母可以利用半纖維素水解液生產(chǎn)木糖醇，然而天然存在的木糖還原酶，其對底物木糖沒有絕對的專一性，在還原木糖的同時也可以催化其它多種糖類特別是阿拉伯糖，生成相應(yīng)的醇，這就導(dǎo)致副產(chǎn)物阿拉伯糖醇的產(chǎn)生。此外，在產(chǎn)物中會殘留一些雜糖，因為很多酵母在木糖存在的情況下，不能夠利用阿拉伯糖、半乳糖等糖類，這樣會增加下游產(chǎn)物分離成本(YoonBH,JeonWY,ShimWY,etal.L-arabinosepathwayengineeringforarabitol-freexylitolproductioninCandidatropicalis[J].BiotechnolLett,2011,33(4):747-753.)。雖然目前發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)木糖還原酶選擇性不高，但作為天然大分子，通過定向進(jìn)化、飽和突變或定向改造提高底物專一性是完全可行的，并且有過很多成功的例子。Woodyer等從粗糙脈孢菌中分離到一株木糖還原酶，其對木糖的催化效率是阿拉伯糖的2.4倍，進(jìn)行靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗時可以顯著提高產(chǎn)物中木糖醇的比例(WoodyerR,SimurdiakM,vanderDonkWA,etal.Heterologousexpression,purification,andcharacterizationofahighlyactivexylosereductasefromNeurosporacrassa[J].ApplEnvironMicrobiol,2005,71(3):1642-1647.)。為了進(jìn)一步提高木糖還原酶對木糖的選擇性，Nair等對其進(jìn)行了定向進(jìn)化，獲得了一個對阿拉伯糖選擇性提高50倍的突變體，在進(jìn)行靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化時，阿拉伯糖醇含量顯著減少，但并沒有完全消除(NairNU,ZhaoH.Evolutioninreverse:engineeringaD-xylose-specificxylosereductase[J].ChemBioChem,2008,9(8):1213-1215.)；為了更進(jìn)一步提高生物催化的選擇性，Nair等構(gòu)建了一株能有效利用阿拉伯糖作為碳源的大腸桿菌(crp*)，此菌聯(lián)合獲得的突變酶在等比例轉(zhuǎn)化葡萄糖、木糖和阿拉伯糖時，產(chǎn)物中已檢測不到阿拉伯糖醇。但是在試驗中使用相同的突變酶，使用大腸桿菌(野生型crp)轉(zhuǎn)化半纖維素水解液時，搖瓶發(fā)酵實驗中有少量阿拉伯糖醇產(chǎn)生，但在發(fā)酵罐發(fā)酵中水解液中幾乎所有阿拉伯糖都轉(zhuǎn)化成阿拉伯糖醇(SuB,WuM,ZhangZ,etal.EfficientproductionofxylitolfromhemicellulosichydrolysateusingengineeredEscherichiacoli[J].MetabEng,2015,31(112–122.))。在阿拉伯糖進(jìn)入細(xì)胞后，可以從以下兩個方面著手減少阿拉伯糖醇的產(chǎn)生：1)木糖還原酶的表達(dá)量相對于代謝阿拉伯糖的酶來說，不能過量太多，否者會阻隔阿拉伯糖和代謝阿拉伯糖的酶，導(dǎo)致阿拉伯糖被還原而不會被代謝，所以控制好木糖還原酶的表達(dá)量對生產(chǎn)高純度木糖醇至關(guān)重要；2)提高木糖還原酶的選擇性，使其對阿拉伯糖的催化活性降低甚至無活性，這樣即使有大量木糖還原酶表達(dá)也不會造成阿拉伯糖醇的產(chǎn)生，但目前來說獲得對木糖絕對專一的木糖還原酶還是比較困難的。為了獲得較高的生產(chǎn)效率和高純度的木糖醇，只有結(jié)合這兩種策略，才能達(dá)到目的。
技術(shù)實現(xiàn)思路
基于現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本專利技術(shù)提供了一種對木糖選擇性高的木糖還原酶突變體。一種木糖還原酶突變體，氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。該木糖還原酶突變體來源為將來自粗糙脈孢菌的木糖還原酶的8個氨基酸分別進(jìn)行突變，8個氨基酸分別突變?yōu)椋篖102V，L107M，L109Q，I110C，V114I，KSN271-273RTT，這些突變點都是對阿拉伯糖識別影響較大而對木糖的識別沒有太大影響，經(jīng)過這些點突變后，所得的木糖還原酶突變體對底物木糖的選擇性會大大提高，降低在木糖醇生產(chǎn)中對阿拉伯糖的識別催化。獲得的木糖還原酶突變體命名為XR-8M。本專利技術(shù)還提供了編碼所述木糖還原酶突變體的基因，命名為xr-8m，基因序列如SEQIDNo.2所示。當(dāng)然，由于密碼子的簡并性，根據(jù)所使用的表達(dá)菌的種類不同，可進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿艽a子優(yōu)化。本專利技術(shù)還提供了所述木糖還原酶突變體在生產(chǎn)木糖醇中的應(yīng)用。本專利技術(shù)還提供了一種基因工程菌，包含所述的基因。轉(zhuǎn)基因方式可以是質(zhì)粒表達(dá)，也可以是將外源基因整合到基因組上，形成穩(wěn)定表達(dá)外源基因的整合型工程菌。所述基因工程菌的宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌、酵母或其他常用于表達(dá)外源基因的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的，所述基因工程菌的宿主細(xì)胞為大腸桿菌。大腸桿菌相對其他宿主細(xì)胞來說，結(jié)構(gòu)簡單，發(fā)酵條件較簡單，成本低，在高效表達(dá)目的基因的前提下，首先選用大腸桿菌。優(yōu)選的，所述木糖還原酶突變體基因整合到大腸桿菌的基因組上，獲得整合型工程菌。基因整合進(jìn)基因組后，不存在質(zhì)粒分離不穩(wěn)定的問題，也不需要添加抗生素，在降低生產(chǎn)成本的同時，減少了抗藥性的問題，并且其表達(dá)不需要誘導(dǎo)劑，進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本。優(yōu)選的，所述木糖還原酶突變體基因的拷貝數(shù)不小于2。拷貝數(shù)的增加有利于提高目的蛋白表達(dá)量本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種木糖還原酶突變體，其特征在于，氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種木糖還原酶突變體，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。
2.編碼如權(quán)利要求1所述的木糖還原酶突變體的基因。
3.一種基因工程菌，其特征在于，包含如權(quán)利要求2所述的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
5.如權(quán)利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因整合到大腸...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳綿斌，蘇卜利，張哲，林建平，楊立榮，
申請(專利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33
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