目的基因轉化蘋果的方法及其在蘋果中瞬時表達目的基因中的應用技術

本發明專利技術公開了目的基因轉化蘋果的方法及其在蘋果中瞬時表達目的基因中的應用。本發明專利技術所提供的蘋果轉化方法，包括用含有目的基因的侵染液侵染蘋果胚原生質體，完成蘋果轉化；蘋果胚原生質體的制備方法包括：A1)將蘋果胚性愈傷組織在懸浮系繼代培養基中進行懸浮繼代培養，得到懸浮細胞；A2)用CPW13M處理懸浮細胞，得到CPW13M處理的懸浮細胞；A3)用纖維素酶和果膠酶酶解CPW13M處理的懸浮細胞得到所述蘋果胚原生質體。實驗證明，本發明專利技術的蘋果轉化方法可以將目的基因在蘋果中進行瞬時表達，可以用來進行目的基因的功能驗證及蛋白質和細胞器的定位，還可用來檢測蛋白質互作及細胞代謝。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
中目的基因轉化蘋果的方法及其在蘋果中瞬時表達目的基因中的應用。
技術介紹
新疆野蘋果(MalussieversiiRoem.)主要分布在中亞天山山脈，被認為是現代栽培蘋果的祖先種，且具有豐富的遺傳多樣性，是常用蘋果砧木中抗旱能力最強的一種，對其抗旱基因的分離研究，有助于揭示果樹對逆境的響應機制。胚性愈傷組織作為一種良好的試驗試材，廣泛應用于植物的遺傳轉化、再生植株等研究，是游離原生質體的良好試材；無細胞壁的原生質體的代謝過程、信號轉導途徑、對環境因素和外來刺激的反應等，都與完整的植物細胞或組織基本相同，通過向原生質體中導入功能基因與報告基因融合的DNA，利用報告基因在植物原生質體中的瞬時表達可以快速準確地進行蛋白質及細胞器定位、相關基因功能研究、蛋白質互作研究及細胞代謝過程研究等，為在細胞水平上研究植物的生理變化、基因表達、信號傳遞等提供了簡便有效的實驗體系。目前新疆野蘋果穩定遺傳轉化體系尚未構建成功，相關基因在本屬植物中的功能研究無法順利開展。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是如何在野生蘋果中進行目的基因的瞬時表達。為解決上述技術問題，本專利技術首先提供了蘋果轉化方法。本專利技術所提供的蘋果轉化方法，包括以蘋果胚原生質體為受體進行蘋果轉化；所述蘋果胚原生質體的制備方法包括下述A1)和A2)：A1)將蘋果胚性愈傷組織進行懸浮繼代培養，得到懸浮細胞；A2)用纖維素酶和果膠酶酶解所述懸浮細胞得到所述蘋果胚原生質體。上述方法中，所述將蘋果胚性愈傷組織進行懸浮繼代培養包括：將所述蘋果胚性愈傷組織在懸浮系繼代培養基中進行懸浮繼代培養，得到懸浮細胞；所述懸浮系繼代培養基為向MS培養基中加入BA、2,4-D、維生素C和蔗糖得到的培養基；所述懸浮系繼代培養基中所述BA、所述2,4-D、所述維生素C和所述蔗糖的濃度可分別為0.5mg/L、3mg/L、2mg/L和質量百分比濃度3％，pH為5.8。上述方法中，所述A1)具體可包括：研磨所述蘋果胚性愈傷組織，得到研磨物；將所述研磨物在所述懸浮系繼代培養基中進行繼代培養，得到所述懸浮細胞。上述目的基因轉化蘋果的方法中，所述研磨蘋果胚性愈傷組織可為用網篩研磨所述蘋果胚性愈傷組織。所述網篩可為不銹鋼網篩，如40目不銹鋼網篩。上述方法中，所述以蘋果胚原生質體為受體進行蘋果轉化可為用含有目的基因的侵染液侵染所述蘋果胚原生質體。所述用含有目的基因的侵染液侵染所述蘋果胚原生質體可為利用PEG介導的原生質體瞬時表達方法完成所述侵染。上述方法中，所述侵染時間可為10-30min，如15min或20min。上述方法中，所述懸浮繼代培養的次數可大于等于2次，每次懸浮繼代培養的時間可為7-10d，如8d。所述懸浮繼代培養可在黑暗、150r/min下進行。所述懸浮繼代培養的溫度可為22-24℃。上述方法中，所述用纖維素酶和果膠酶酶解所述懸浮細胞前還包括將所述懸浮細胞用CPW13M進行處理；所述CPW13M為向細胞-原生質體清洗液(cellprotoplastwashmedium，以下簡稱CPW溶液)中加入甘露醇得到的溶液；所述CPW13M中甘露醇的質量百分比濃度可為11％-15％(如13％)。其中，所述CPW溶液由水和溶質組成，所述CPW溶液的溶質及其濃度分別為KH2PO427.2mg/L、KNO3101.0mg/L、CaCl2·2H2O1480.0mg/L、MgSO4·7H2O246.0mg/L、KI0.16mg/L及CuSO4·5H2O0.025mg/L。上述方法中，用所述CPW13M處理所述懸浮細胞的時間可為0.5-2h。所述用所述CPW13M處理所述懸浮細胞的浸泡時間具體可為1h。上述方法中，所述纖維素酶、所述果膠酶和所述CPW13M處理的懸浮細胞的比例可為100U:15U:10mL。上述方法中，所述A2)可包括A21)和A22)：A21)用含有所述纖維素酶和所述果膠酶酶的酶液浸泡所述懸浮細胞，得到酶-原生質體混合液；A22)將所述酶-原生質體混合液加至CPW25S上，得到下層為CPW25S上層為酶-原生質體混合液的分層液體1；將所述分層液體1進行離心，使原生質體位于所述分層液體1的界面處，分離原生質體，得到所述蘋果胚原生質體；所述CPW25S為向所述CPW溶液中加入蔗糖得到的溶液；所述CPW25S中蔗糖質量百分比濃度具體可為23％-27％(如25％)。上述方法中，所述酶液由溶質和溶劑組成；所述溶劑為所述CPW溶液，所述溶質及其濃度分別為100000U/L所述纖維素酶、15000U/L所述果膠酶、0.65mol/LD-mannitol、1.0％(質量百分比濃度)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.1％(質量百分比濃度)MES和0.1％(質量百分比濃度)BSA，pH為5.6。上述方法中，用所述酶液浸泡所述懸浮細胞可在弱光(如500lux以下)、22-24℃、40r/min下進行。用所述酶液浸泡所述CPW13M處理的懸浮細胞的時間可為15-25h，如20h。上述方法中，所述纖維素酶可為CellulaseR-10。所述果膠酶可為PectolaseY-23。所述CellulaseR-10具體可為北京優尼康生物科技有限公司產品，貨號為C8260-100。所述PectolaseY-23具體可為北京美萊博醫學科技有限公司產品，貨號為MMF-1069。上述方法中，所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法可包括：將蘋果胚在誘導培養基上進行誘導培養得到蘋果胚性愈傷組織；所述誘導培養基為向MS培養基中加入BA、2,4-D和蔗糖得到的固體培養基；其中，所述誘導培養基中BA、2,4-D和蔗糖的濃度分別可為3mg/L、1mg/L和3％(質量百分比濃度)。上述方法中，所述誘導培養可在22-24℃、黑暗下進行。所述誘導培養的培養時間可為7-21d，如14d。上述方法中，所述蘋果胚為盛花后60-80d的蘋果胚。上述方法中，所述盛花后60-80d具體可為盛花后70d。上述方法中，所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法還包括將所述蘋果胚性愈傷組織在繼代培養基上進行繼代培養；所述繼代培養基為向MS培養基中加入BA、2,4-D和蔗糖得到的固體培養基；其中所述繼代培養基中BA、2,4-D和蔗糖的濃度分別可為4mg/L、2mg/L和3％(質量百分比濃度)。上述方法中，所述繼代培養可在22-24℃、黑暗下進行。所述繼代培養的培養時...

【技術保護點】
蘋果轉化方法，包括以蘋果胚原生質體為受體進行蘋果轉化；所述蘋果胚原生質體的制備方法包括下述A1)和A2)：A1)將蘋果胚性愈傷組織進行懸浮繼代培養，得到懸浮細胞；A2)用纖維素酶和果膠酶酶解所述懸浮細胞得到所述蘋果胚原生質體。

【技術特征摘要】
1.蘋果轉化方法，包括以蘋果胚原生質體為受體進行蘋果轉化；
所述蘋果胚原生質體的制備方法包括下述A1)和A2)：
A1)將蘋果胚性愈傷組織進行懸浮繼代培養，得到懸浮細胞；
A2)用纖維素酶和果膠酶酶解所述懸浮細胞得到所述蘋果胚原生質體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述用纖維素酶和果膠酶酶解所述
懸浮細胞前還包括將所述懸浮細胞用CPW13M進行處理；所述CPW13M為向細胞-原生質
體清洗液中加入甘露醇得到的甘露醇的質量百分比濃度為11％-15％的溶液。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：用所述CPW13M處理所述懸浮細胞
的時間為0.5-2h。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述A2)包括A21)和
A22)：
A21)用含有所述纖維素酶和所述果膠酶酶的酶液浸泡所述懸浮細胞，得到酶-原
生質體混合液；
A22)將所述酶-原生質體混合液加至CPW25S上，得到下層為CPW25S上層為酶-
原生質體混合液的分層液體1；將所述分層液體1進行離心，使原生質體位于所述分
層液體1的界面處，分離原生質體，得到所述蘋果胚原生質體；
所述CPW25S為向所述CPW溶液中加入蔗糖得到的溶液；所述CPW25S中蔗糖質量
百分比濃度為23％-27％。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述蘋果胚性愈傷組織的
制備方法包括：將蘋果胚在誘導培養基上進行誘導培養得到蘋果胚性愈傷組織；
所述誘導培養基為向MS培養基中加入BA、2,4-D和蔗糖得到的固體培養基。
6.根據權利要求4或5所述方法，其特征在于：所述蘋果胚性愈傷組織的制備方
法還包括將所述蘋果胚性愈傷組織在繼代培養基上進行繼代培養；
所述繼代培養基為向MS培養基中加入BA、2,4-D和蔗糖得到的固體培養基。
7.根據權...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李天紅，劉冬，郭蕭，趙迪，王彥濤，
申請(專利權)人：中國農業大學，
類型：發明
國別省市：北京;11