一種熱穩定性高的果糖基肽氧化酶及其編碼基因和用途制造技術

本發明專利技術涉及酶工程領域，公開了一種果糖基肽氧化酶及其編碼基因，該果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1或2所示。本發明專利技術還公開了具有所述基因的重組載體及含有該重組載體的轉化子。本發明專利技術還公開了所述果糖基肽氧化酶、基因、重組載體或轉化子在酶法檢測糖化血紅蛋白中的應用。此外，本發明專利技術公開了一種增強果糖基肽氧化酶的熱穩定性的方法，包括將來源于土正青霉的果糖基肽氧化酶的氨基酸殘基進行置換，所述置換的方式包括第29位精氨酸置換為賴氨酸、第85位苯丙氨酸置換為酪氨酸和第94位甲硫氨酸置換為賴氨酸中的至少一種。通過上述技術方案，本發明專利技術獲得了熱穩定性明顯提高的果糖基肽氧化酶，使得該酶更適合推廣應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及酶工程領域，具體地，涉及一種熱穩定性高的果糖基肽氧化酶及其編碼基因和用途。
技術介紹
糖尿病在中國屬于高發病率慢性疾病，平均十個人就有一人是糖尿病患者。目前中國已成為全球糖尿病患病人數最多、患病率最高的國家。糖尿病嚴重危害到患者的健康，影響其生活質量，因此對糖尿病的治療和監測顯得十分重要。在人體紅細胞120天生命周期內，血紅蛋白可以持續被糖基化，而糖化血紅蛋白形成的速率與血糖濃度成正比，因此糖化血紅蛋白的含量反映了2-3個月血糖控制的情況。研究發現，與單純的血糖水平相比，糖化血紅蛋白的水平用于診斷糖尿病能更好地反映長期血糖控制和慢性并發癥的風險，具有生物變異性較小、無需空腹采血等優點。臨床上檢測糖化血紅蛋白的方法有很多，其中基于果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)或果糖基肽氧化酶(FPOD)的酶法檢測因具有操作簡單、快速、價廉、精密度高等優點引起越來越多的關注。酶法檢測糖化血紅蛋白的原理是：首先糖化血紅蛋白在蛋白酶的作用下分解釋放出果糖基纈氨酸(Fructosyl-aN-valine，f-αVal)或果糖基二肽(f-αVal-His)，然后果糖基纈氨酸或果糖基二肽在FAOD或FPOD的作用下分解，反應過程中會產生雙氧水，雙氧水在過氧化物酶的作用下與特定的發色底物發生反應，顏色變化的程度與糖化血紅蛋白的量呈正相關。目前研究發現的適用于酶法檢測糖化血紅蛋白的果糖基肽氧化酶大多來源于真菌，這些真菌都不屬于耐熱菌或嗜熱菌，因此其產生的酶一般不具有耐熱性，這極大地限制了果糖基肽氧化酶的應用，也就限制了酶法檢測糖化血紅蛋白試劑盒的應用和推廣。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有果糖基肽氧化酶熱穩定性不高的缺點，提供一種熱穩定性高的酶突變體及其編碼基因和相關用途。為了實現上述目的，本專利技術的專利技術人利用生物技術手段對來源于土正青霉(Eupenicilliumterrenum)的果糖基肽氧化酶進行了改造，發現突變(置換)其第29、85和94位氨基酸殘基中的至少一個可有效改變其熱穩定性，因此，第一方面，本專利技術提供了一種果糖基肽氧化酶，該果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO:1或2所示。第二方面，本專利技術提供了編碼第一方面所述的果糖基肽氧化酶的基因。第三方面，本專利技術提供了具有第二方面所述的基因的重組載體。第四方面，本專利技術提供了含有第三方面所述的重組載體的轉化子。第五方面，本專利技術提供了第一方面所述的果糖基肽氧化酶、第二方面所述的基因、第三方面所述的重組載體或第四方面所述的轉化子在酶法檢測糖化血紅蛋白中的應用。第六方面，本專利技術提供了一種增強果糖基肽氧化酶的熱穩定性的方法，該方法包括將來源于土正青霉的果糖基肽氧化酶的氨基酸殘基進行置換，所述置換的方式為：第94位甲硫氨酸置換為賴氨酸；或第29位精氨酸置換為賴氨酸和第85位苯丙氨酸置換為酪氨酸；或第29位精氨酸置換為賴氨酸、第85位苯丙氨酸置換為酪氨酸和第94位甲硫氨酸置換為賴氨酸。通過上述技術方案，本專利技術獲得了熱穩定性明顯提高的果糖基肽氧化酶，使得該酶更適合推廣應用。本專利技術的其它特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。附圖說明附圖是用來提供對本專利技術的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本專利技術，但并不構成對本專利技術的限制。在附圖中：圖1為野生型果糖基肽氧化酶及本專利技術獲得的果糖基肽氧化酶經純化后的SDS-PAGE電泳圖。具體實施方式以下對本專利技術的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本專利技術，并不用于限制本專利技術。在本專利技術中，在未作相反說明的情況下，使用的術語“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力單位表示，即酶單位(U)，本專利技術中酶單位的定義是：在37℃、pH8的條件下，每分鐘產生1μmol氨基酸產物所需要的酶量定義為一個酶單位，即1U＝1μmol/min；“酶的比活力”代表每單位質量蛋白質的催化能力，能夠反應酶活性大小，其值越大，表明酶活性越高，比活力的計算公式為：比活力(U/mg)＝總酶活力單位數/mg總蛋白；“熱穩定性”是指果糖基肽氧化酶對溫度的敏感性，能夠反應酶對熱處理的耐受力，熱穩定性高是指經加熱處理一段時間酶仍具有較高的比活力。組成蛋白質的20種氨基酸，按照側鏈極性可以分成四類：1、非極性的氨基酸：丙氨酸(Ala，A)、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)和脯氨酸(Pro，P)；2、極性不帶電荷的氨基酸：甘氨酸(Gly，G)、絲氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酰胺(Gln，Q)和酪氨酸(Tyr，Y)；3、帶正電荷的氨基酸：精氨酸(Arg，R)、賴氨酸(Lys，K)和組氨酸(His，H)；4、帶負電荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)。本專利技術中使用的縮寫“R29K”是指第29位的R殘基突變為K殘基，依此類推；單位M＝mol/L，相應地，mM＝mmol/L，依此類推。第一方面，本專利技術提供的果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如下面的SEQIDNO:1或2所示。MAHSRASTKVVVVGGGGTIGSSTALHLIKSGYTPSNITVLDVYKTPSLQSAGHDLNKIMGIRLRNGPDLQLSLESLDMWQNDELYKPFFHQVGXIDCSSSKEGIENLRRKYQTLLDAGIGLEKTNVWLESEDEILAKAPNFTREQVKGWKGLFCTDGGWLAAAKAINAIGIFLQDKGVKFGFGGAGTFQQPLFAADGKTCIGLETTDGTKYFADKVVLAAGAWSPTLVDLEDQCVSKAWVFAHIQLTPKEADAYKNVPVVYDGEYGFFFEPNEYGVIKVCDEFPGFSRFKLHQPYGAASPKMISVPRSHAKHPTDTYPDASEVTIRKAIARFLPEFKDKELFNRTMCWCTDTADANLLICEHPKWKNFILATGDSGHSFKLLPNIGKHVVELLEGSLSQEMAGAWRWRPGGDALRSRRGAPAKDLAEMPGWKHDAHL(SEQIDNO:1，其中X＝M或K)MAHSRASTKVVVVGGGGTIGSSTALHLIRSGYTPSNITVLDVYKTPSLQSAGHDLNKIMGIRLRNGPDLQLSLESLDMWQNDELFKPFFHQVGKIDCSSSKEGIENLRRKYQTLLDAGIGLEKTNVWLESEDEILAKAPNFTREQVKGWKGLFCTDGGWLAAAKAINAIGIFLQDKGVKFGFGGAGTFQQPLFAADGKTCIGLETTDGTKYFADKVVLAAGAWSPTLVDLEDQCVSKAWVFAHIQLTPKEADAYKNVPVVYDGEYGFFFEPNEYGVIKVCDEFPGFSRFKLHQPYGAASPKMISVPRSHAKHPTDTYPDASEVTIRKAIARFLPEFKDKELFNRTMCWCTDTADANLLICEHPK本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種果糖基肽氧化酶，其特征在于，該果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1或2所示。

【技術特征摘要】
1.一種果糖基肽氧化酶，其特征在于，該果糖基肽氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO:1或2所示。2.編碼權利要求1所述的果糖基肽氧化酶的基因。3.一種重組載體，該重組載體具有權利要求2所述的基因。4.一種轉化子，該轉化子含有權利要求3所述的重組載體。5.權利要求1所述的果糖基肽氧化酶、權利要求2所述的基因、權利要求3所述的重組載體或權利要求4所述的轉化子在酶法檢測糖化血紅蛋...

【專利技術屬性】
技術研發人員：龔為民，邢克克，劉海萍，甘偉瓊，李亞峰，
申請(專利權)人：中國科學院天津工業生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：天津;12