含有Fc的多肽的穩定化制造技術

本公開提供包含抗體Fc區的多肽，所述抗體Fc區在鉸鏈區中缺失一個或多個半胱氨酸殘基，并且一個或多個CH3界面氨基酸被含有巰基的殘基取代。此外，提供含有所述多肽的Fc融合蛋白和抗體、編碼所述多肽的核酸和載體，以及用于制備所述多肽的宿主細胞和方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】相關申請的交叉引用本申請要求2013年7月31日提交的美國臨時申請號61/860,800的權益，所述美國臨時申請據此以引用的方式并入本文。序列表本申請含有已以ASCII格式電子提交，并且據此以引用的方式整體并入本文的序列表。2014年7月28日創建的所述ASCII拷貝名為A-1852-WO-PCT_SL.txt，并且大小為122,988字節。背景在生物制藥行業內，抗體已變為主要選擇，因為它們具有對開發治療性分子者具有吸引力的若干特征。連同靶向特定結構或細胞的能力一起，抗體使得它的靶標易感于Fc受體細胞介導的吞噬和殺滅(Raghavan和Bjorkman1996)。此外，抗體以pH依賴性方式與新生兒Fc受體(FcRn)相互作用的能力賦予它延長的血清半衰期(Ghetie和Ward2000)。抗體的這個獨特特征允許通過工程改造Fc融合分子來延長治療性蛋白質或肽在血清中的半衰期?？贵w屬于免疫球蛋白類別的蛋白質，其包括IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。在人血清中最充足的免疫球蛋白類別是IgG，其示意性結構顯示于圖1中(Deisenhofer1981；Huber1984；Roux1999)。IgG結構具有四個鏈，即兩個輕鏈和兩個重鏈；各輕鏈具有兩個結構域，并且各重鏈具有四個結構域?？乖Y合位點位于含有可變輕(VL)鏈和可變重(VH)鏈結構域以及恒定輕(LC)鏈和恒定重(CH1)鏈結構域的Fab區r>(抗原結合片段)中。重鏈的鉸鏈、CH2和CH3結構域區域被稱為Fc(可結晶片段)。IgG分子可被視為具有兩個在鉸鏈區處通過二硫鍵(-S-S-)保持在一起的重鏈和兩個輕鏈的異四聚體。在免疫球蛋白子類之間，鉸鏈二硫鍵的數目不同(Papadea和Check1989)。FcRn結合位點位于抗體的Fc區中(Martin，West等2001)，并且因此抗體的延長的血清半衰期性質被保持在Fc片段中。單獨Fc區可被認為是包含鉸鏈、CH2和CH3結構域的重鏈的同二聚體。天然存在的IgG抗體的Fc區是同二聚體，并且可以二聚體形式表達和純化。如上所討論，抗體的Fc區通過FcRn再循環機理賦予血清半衰期。因此，Fc用作融合伴侶以延長治療性蛋白質、肽(肽體)和蛋白質結構域的血清半衰期。然而，對于一些治療應用，可能必要的是缺失鉸鏈區，此移除形成Fc的兩個多肽鏈之間的共價連接。舉例來說，當使Fc融合于含有內部二硫鍵或游離半胱氨酸殘基的蛋白質時，鉸鏈二硫化物可干擾折疊，并且導致聚集。然而，移除鉸鏈區會消除兩個多肽鏈之間的共價連接。這可導致在制造階段或體內期間兩個Fc鏈之間的非共價相互作用解離，并且導致Fc鏈與其它蛋白質/分子的締合。概述如本文所公開，通過在CH3結構域界面處引入二硫鍵，可改進在鉸鏈區內缺乏二硫鍵的含有Fc的分子的熱穩定性。此外，共價連接保持在Fc結構中形成二聚體的兩個多肽鏈完整，而不在體外或在體內解離。如圖3中所示，在某些實施方案中，在WT缺失鉸鏈Fc同二聚體和突變缺失鉸鏈Fc異二聚體中兩個Fc鏈之間的唯一共價連接是引入的二硫鍵。在某些實施方案中，一個或多個在兩個CH3結構域上組成CH3-CH3界面的殘基被含有巰基的殘基置換以使相互作用因在CH3結構域之間形成二硫鍵(-S-S-)而變得穩定。在優選實施方案中，界面中的氨基酸，諸如亮氨酸、蘇氨酸、絲氨酸或酪氨酸，被半胱氨酸或甲硫氨酸，優選被半胱氨酸置換。在某些實施方案中，氨基酸被具有所需電荷特征的非天然氨基酸，諸如高半胱氨酸或谷胱甘肽置換。在本專利技術的第一方面，多肽包含在鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸被缺失或取代，并且一個或多個CH3界面氨基酸被含有巰基的殘基(優選是半胱氨酸)取代的抗體Fc區。鉸鏈區可借助于取代或通過缺失而缺乏半胱氨酸殘基。在某些實施方案中，Fc完全缺乏鉸鏈區。在其它實施方案中，僅一部分鉸鏈區缺失，優選是包含半胱氨酸殘基的部分。在第一方面的某些實施方案中，CH3界面氨基酸Y349、L351、S354、T394或Y407被含有巰基的殘基(優選是半胱氨酸)取代。在優選實施方案中，Fc包含L351C取代。當兩個具有L351C取代的含有Fc的多肽在適當條件下相互作用時，在兩個鏈中的L351C殘基之間形成二硫鍵。類似地，當兩個具有T394C取代的含有Fc的多肽在適當條件下相互作用時，在兩個鏈中的T394C殘基之間形成二硫鍵。此外，當兩個具有Y407C取代的含有Fc的多肽在適當條件下相互作用時，在兩個鏈中的Y407C殘基之間形成二硫鍵。當具有Y349C取代的含有Fc的多肽與具有S354C取代的含有Fc的多肽在適當條件下相互作用時，在一個鏈中的Y349C殘基與另一鏈中的S354C殘基之間形成二硫鍵。第一方面的多肽的Fc區可在CH2和/或CH3區中含有一個或多個其它氨基酸取代。在優選實施方案中，Fc區在CH2區中包含一個或多個氨基酸取代，其相較于具有野生型CH2的類似蛋白質，改變含有Fc的蛋白質的效應物功能。在其它實施方案中，Fc區在CH3區中包含一個或多個氨基酸取代，其改變含有Fc的多肽同二聚的能力和/或增加與在CH3區中具有互相作用性氨基酸取代的含有Fc的多肽異二聚的能力。在某些實施方案中或在第一方面，Fc的C末端的一個或多個氨基酸被缺失或取代。在優選實施方案中，C末端賴氨酸被缺失或取代成另一氨基酸。在其它實施方案中，兩個或三個末端氨基酸被缺失或取代成另一氨基酸。在第一方面的某些實施方案中，多肽是抗體重鏈。在其它實施方案中，多肽是Fc融合蛋白。Fc融合蛋白可在Fc分子的N末端和/或C末端含有接頭。在本專利技術的第二方面，核酸編碼第一方面的多肽。在第三方面，表達載體包含可操作地連接于調控序列，諸如異源性啟動子和/或增強子的第二方面的核酸。在第四方面，宿主細胞包含第三方面的表達載體。在優選實施方案中，宿主細胞是真核細胞，諸如酵母或哺乳動物細胞系。優選的哺乳動物細胞系是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。本專利技術的第五方面是一種制備第一方面的多肽的方法。方法包括在其中調控區在宿主細胞中具有活性的條件下培養第四方面的宿主細胞，以及從培養物分離多肽。在第六方面，藥物組合物包含第一方面的多肽。附圖簡述圖1.具有指示的各結構域的IgG1抗體的示意圖。IgG1抗體是具有兩個重鏈(較長長度)和兩個輕鏈(較短長度)的Y形四聚體。兩個...

【技術保護點】
一種包含抗體Fc區的多肽，所述Fc區包含鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸的缺失或取代，以及一個或多個CH3界面氨基酸被含有巰基的殘基取代。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2013.07.31 US 61/8608001.一種包含抗體Fc區的多肽，所述Fc區包含鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸的缺失或取代，以及一個或多個CH3界面氨基酸被含有巰基的殘基取代。
2.如權利要求1所述的多肽，其中所述Fc缺乏所述鉸鏈區的含有半胱氨酸的部分。
3.如權利要求2所述的多肽，其中所述Fc缺乏所述鉸鏈區。
4.如權利要求1所述的多肽，其中所述鉸鏈區內的所有半胱氨酸都被取代成另一氨基酸。
5.如權利要求1至4中任一項所述的多肽，其中被含有巰基的殘基取代的CH3界面氨基酸是Y349、L351、S354、T394或Y407。
6.如權利要求5所述的多肽，其中Y349被半胱氨酸取代(Y349C)。
7.如權利要求5所述的多肽，其中L351被半胱氨酸取代(L351C)。
8.如權利要求5所述的多肽，其中S354被半胱氨酸取代(S354C)。
9.如權利要求5所述的多肽，其中T394被半胱氨酸取代(T394C)。
10.如權利要求5所述的多肽，其中Y407被半胱氨酸取代(Y407C)。
11.如權利要求1至10中任一項所述的多肽，其中所...

【專利技術屬性】
技術研發人員：G肯南，J拉瓦李，FW雅各布森，
申請(專利權)人：美國安進公司，
類型：發明
國別省市：美國;US