編碼截短型人角質細胞生長因子的基因及其制備方法技術

本發明專利技術提供一種編碼截短型人角質細胞生長因子的基因，其是下列核苷酸序列中的一種：1)序列表中的SEQ?ID?No:1；2)與序列表中的SEQ?ID?No:1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。一種制備截短型人角質細胞生長因子蛋白的方法：(1)使用人工全基因合成截短型人角質細胞生長因子和成熟信號肽的融合基因的序列制備質粒；(2)發酵培養誘導表達得到產品。該方法簡便而且能高效表達基因重組截短型人角質細胞生長因子。截短型人角質細胞生長因子在發酵罐中的表達量可達250mg/L以上，是野生型的3倍以上。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體涉及編碼截短型人角質細胞生長因子的基因和利用該基因提高截短型人角質細胞生長因子在畢赤酵母工程菌中表達水平的方法。
技術介紹
角質細胞生長因子(keratinocytegrowthfactor，KGF)是RubinJS等人1989從胚胎肺成纖維細胞培養上清中發現的，為成纖維細胞生長因子(f1ibroblastgrowthfactor，FGF)家族一員，又稱FGF-7。由于其具有促小鼠角質細胞有絲分裂的能力，故命名為角質細胞生長因子。人角質細胞生長因子(hKGF)基因編碼194個氨基酸殘基的蛋白質,包含一個供分泌的信號肽(由31個氨基酸殘基組成)和位于N端的糖基化位點。成熟的hKGF由163個氨基酸組成，由于受糖基化的影響，分子量約為26～28kDa。天然hKGF的穩定性較差，活性易受環境影響，生物半衰期短，在溫和的溫度下也容易聚合。實驗證實hKGF的N端23個氨基酸殘基缺失后的截短形重組hKGF(Mw16.3kDa)的穩定性較高，同時體內外生物學作用和活性也保持不變。由美國Amgen公司所生產的重組KGF藥物Kepivance(Palifermin)就是大腸桿菌表達的截短形重組人角質細胞生長因子。在本專利技術中，目標蛋白也是截短形重組hKGFKGF由間質細胞分泌，通過旁分泌的途徑作用于上皮細胞。其生物學功能研究結果顯示：KGF在體外不僅能夠促進角質細胞的生長和增殖，而且對其凋亡具有抑制作用，還對細胞的移行具有影響。動物模型研究表明，KGF在促進皮膚創口愈合，預防放化療引起的粘膜炎，以及治療潰瘍和腸炎等方面都有顯著療效，甚至還可以促進毛發生長。這些都表明該蛋白質不僅可以用于藥物，還可以作為生物美容的新成員，應用于美容化妝品行業中。從大腸桿菌中提取重組KGF受材料來源和提取技術的限制，常常需要通過復性才能得到可溶性蛋白，其純度不高，含量較低；而雜質多也會帶來許多安全方面如抗原性的問題。隨著酵母基因工程的發展，利用酵母菌來生產KGF將成為一個更為合適的選擇。酵母表達系統是基因工程研究中最常用的表達系統之一，其優點為操作簡單、易擴大培養、成本低，而且可進行翻譯后修飾。近年來畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統的發展尤為迅速，在重組蛋白質表達方面用途極廣，成為現代蛋白質基因工程藥物表達的首選。但是，隨著新的外源蛋白在該系統中的表達，也逐漸暴露出了一些潛在的問題，如有的蛋白質表達水平低下，新生多肽在內質網腔中出現聚集而無法分泌至胞外以及蛋白折疊錯誤等。因此，開發一種在酵母中高表達的方法成為本領域技術亟需解決的技術問題。
技術實現思路
本專利技術解決的技術問題是提供一種截短型人角質細胞生長因子的基因，以及該基因與成熟信號肽的融合基因。進一步地，本專利技術解決的技術問題是提供一種高表達生產截短型人角質細胞生長因子蛋白的方法。本專利技術的專利技術構思如下：本專利技術的專利技術人發現：在用畢赤酵母表達系統生產重組蛋白時，外源基因的密碼子是影響基因異源表達的重要參數之一。要盡量避免引入稀有密碼子以防止在翻譯過程中產生瓶頸效應，而酵母偏好性密碼子的引入通常則與蛋白產量正相關。另外，分泌信號肽是蛋白質分泌轉運過程中引導新生肽鏈轉移到內質網腔膜上并引導蛋白質分子分泌到特定位置的一段氨基酸序列，因此信號肽對蛋白質的分泌非常重要。在商業化的質粒如pPIC9K中，分泌信號肽為來自釀酒酵母的成熟信號肽(α-factor)。同一蛋白質可通過多種信號肽在畢赤酵母中分泌表達，但表達水平存在差異，所以對信號肽的基因序列進行優化，也可以提高蛋白產量的一種方法。基于上述的發現，本專利技術利用畢赤酵母的密碼子偏好性進行基因(包括成熟信號肽和截短型人角質細胞生長因子的基因)序列優化，以達到提高蛋白產量的目的。更具體來說，本專利技術通過如下技術方案解決上述技術問題的。一種編碼截短型人角質細胞生長因子的基因，其特征在于，其是下列核苷酸序列中的一種：1)序列表中的SEQIDNo:1；2)與序列表中的SEQIDNo:1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。其中，所述截短型人角質細胞生長因子與成熟信號肽的融合基因是下列核苷酸序列中的一種：1)序列表中的SEQIDNo:2；2)與序列表中的SEQIDNo:2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。其中，所述成熟信號肽的基因是下列核苷酸序列中的一種：1)序列表中的SEQIDNo:3；2)與序列表中的SEQIDNo:3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。本專利技術還提供含有上述基因的表達載體。本專利技術還提供含有上述基因的細胞系。一種制備截短型人角質細胞生長因子蛋白的方法，所述方法包括如下步驟：(1)制備質粒：人工全基因合成截短型人角質細胞生長因子和成熟信號肽的融合基因的序列，然后將其進行BamHI/NotI雙酶切并連接至pPIC9K載體，構建pPIC9K-α-KGFΔ23質粒；利用對pPIC9K-α-KGFΔ23重組質粒線性化，電穿孔轉化至畢赤酵母菌中，篩選高拷貝轉化子；(2)發酵培養誘導表達：將步驟(1)得到的高拷貝轉化子進行發酵培養，表達得到截短型人角質細胞生長因子蛋白產品。其中，所述方法中截短型人角質細胞生長因子和成熟信號肽的融合基因是下列核苷酸序列中的一種：1)序列表中的SEQIDNo:2；2)與序列表中的SEQIDNo:2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。其中，所述方法中截短型人角質細胞生長因子的基因是下列核苷酸序列中的一種：1)序列表中的SEQIDNo:1；2)與序列表中的SEQIDNo:1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。其中，所述成熟信號肽的基因是下列核苷酸序列中的一種：1)序列表中的SEQIDNo:3；2)與序列表中的SEQIDNo:3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。其中，步驟(2)所述電轉化的條件是電壓1.5kV，電容25μF，電阻200Ω，電擊時間為約5msec。本專利技術還提供一種通過所述方法制備得到截短型人角質細胞生長因子蛋白。本專利技術還提供一種含有所述截短型人角質細胞生長因子蛋白的藥物，化妝品。另外，本專利技術還提供了截短型人角質細胞生長因子工程菌的構建方法，其包括下述步驟：(1)成熟信號肽基因序列的設計：用畢赤酵母密碼子的偏好性，設計成熟信號肽的基因序列如序列表中SEQID：3(2)成熟信號肽和截短型人角質細胞生長因子的融合基因序列的設計：hKGF的cDNA序列來自PubMED，Accession：S81661。刪去hKGF基因52端69個核苷酸，余下420個堿基即為截短型人角質細胞生長因子的核苷酸序列。在不改變截短型人角質細胞生長因子氨基酸序列的基礎上按照畢赤酵母密碼子偏好性進行基因設計獲得成熟信號肽和截短型人角質細胞生長因子的融合基因序列為序列表中的SEQIDNo:2；(3)將步驟(2)設計的融合基因序列進行人工全合成，之后對其進行雙酶切后連接至pPIC9K載體，得到pPIC9K-α-KGFΔ23重組質粒；用SalI對pPI本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種編碼截短型人角質細胞生長因子的基因，其特征在于，其是下列核苷酸序列中的一種：1)序列表中的SEQ?ID?No:1；2)與序列表中的SEQ?ID?No:1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。

【技術特征摘要】
1.一種編碼截短型人角質細胞生長因子的基因，其特征在于，其是下列核苷酸序列中的一種：1)序列表中的SEQIDNo:1；2)與序列表中的SEQIDNo:1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。2.如權利要求1所述的基因，其特征在于，所述截短型人角質細胞生長因子與成熟信號肽的融合基因是下列核苷酸序列中的一種：1)序列表中的SEQIDNo:2；2)與序列表中的SEQIDNo:2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。3.如權利要求2所述基因，其特征在于，所述成熟信號肽的基因是下列核苷酸序列中的一種：1)序列表中的SEQIDNo:3；2)與序列表中的SEQIDNo:3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。4.含有權利要求1或2所述基因的表達載體。5.含有權利要求1或2所述基因的細胞系。6.一種制備截短型人角質細胞生長因子蛋白的方法，所述方法包括如下步驟：(1)制備質粒：人工全基因合成截短型人角質細胞生長因子和成熟信號肽的融合基因的序列，然后將其進行BamHI/NotI雙酶切并連接至pPIC9K載體，構建pPIC9K-α-KGFΔ23質粒；利用對pPIC9K-α-KGFΔ23重組質粒線性化，電穿孔轉化至畢赤酵母菌中，篩選高拷貝轉化子；以及(...

【專利技術屬性】
技術研發人員：龍飛，李曉穎，李敏，楊小琳，趙金禮，
申請(專利權)人：陜西東大生化科技有限責任公司，
類型：發明
國別省市：陜西;61