以愈傷組織誘導白及四倍體的方法技術

本發明專利技術公開了以愈傷組織誘導白及四倍體的方法，利用化學誘導劑0.05～0.2%秋水仙素+3%DMSO對愈傷組織進行短時間誘導處理，再進行增殖、分化和生根培養，經實驗統計白及四倍體誘導率為2.6%～23.4%。采用本發明專利技術方法既可以提高四倍體的誘導率，又能減少化學誘導劑對細胞毒害作用。根據細胞全能性原理，再分化過程中，一個細胞分化為一個植株，可有效減少雜合體的發生。因此，該方法具有操作簡單、易控制、重復性好、誘導率高、多倍體的純化率好等優點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于植物生物
，具體是一種以愈傷組織誘導白及四倍體的方法。
技術介紹
白及（Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.）又名白芨、別名紫蘭，是蘭科白及屬多年生草本植物。其塊莖為我國傳統中藥，其性微寒，味苦、甘，具收斂、化瘀止血、補肺生肌、消腫，用于治療肺病、咳血、慢性胃潰瘍、創傷出血和肝癌等癥；為“快胃片”、“胃康寧”等中成藥的重要組分。此外，白及在美容護膚、精細化工及觀賞園藝等方面也有重要的應用價值。目前白及原料主要依賴野生自然資源，過度的采集和生境的破壞使資源數量急劇減少，瀕臨滅絕邊緣。隨著白及研究不斷深入，應用日益廣泛，市場需求量逐年增加，使得供需矛盾日益尖銳，價格持續上揚，已達400～500元∕kg。因此，白及人工栽培勢在必行。在自然條件下，由于白及的種子細小且無胚乳，萌發率極低。人們主要通過采集本地的野生白及以分株繁殖方式繁育種苗，存在品種混雜、繁殖系數低、種質退化嚴重等諸多問題。而培育優質高產白及品種是人工栽培獲得成功的關鍵所在。植物多倍體具有植株“巨型性”、有效成分含量高、抗逆性強等特性，成為了提高藥用植物品質、產量和抗逆性的重要育種途徑。如四倍體粉葛比野生二倍體生物產量提高十幾倍；杭白芷多倍體藥用成分歐前胡素含量比原植物高2倍。由此可見，多倍體是增產效應和藥用成分含量得以大幅提高兩個方面的完美結合的統一體，非常適合藥用部位為塊根、塊莖以及全株的藥用植物。我國先后培育出了牛膝、丹參、菘藍、黨參等30多個中藥多倍體新品種。目前，利用化學誘導劑對白及種子進行多倍體誘導研究已有報道，因白及種子細小，在誘導后進行清洗時，種子懸浮于水中，雖然可以通過離心方式解決，但由于白及種子必須在培養基上才能萌發，而反復在超凈工作臺和離心機之間進行清洗工作，使種子污染率大幅增加，嚴重時會因整個處理全部污染而導致試驗失敗。
技術實現思路
本專利技術針對白及種子進行多倍體誘導過程中存在的問題，利用白及愈傷組織進行白及四倍體誘導。本專利技術以愈傷組織誘導白及四倍體的方法，包括以下步驟：（1）在超凈工作臺上，將白及愈傷組織切分成0.3cm×0.3cm的小塊，接入增殖培養基中培養10d；在無菌條件下，往培養瓶中加入滅菌過的化學誘導劑，化學誘導劑浸泡愈傷組織8～24h；所述的化學誘導劑為：0.05～0.2%秋水仙素+3%DMSO；所述增殖培養基為：N6+2,4-D1.0mg/L+NAA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L，pH6.0；經過誘導的白及愈傷組織細胞通透性增加，N6中的鉀元素可調節細胞內適宜滲透壓和酸堿平衡，參與細胞內糖和蛋白質代謝，N6與植物生長調節劑共同作用，促進誘導過的白及愈傷組織細胞的修復和生長。（2）在超凈工作臺上，將步驟（1）中的愈傷組織取出，放入無菌水中清洗，用無菌濾紙吸干水，接入分化培養基中培養，22～30d產生芽點，36～43d形成芽，55～65d芽長出2～3片葉，芽粗壯，葉色綠色；所述分化培養基為：MS+6-BA1.0mg/L+ZT0.5mg/L+NAA0.5mg/L，pH6.0；ZT與6-BA具有促進白及愈傷組織細胞的分裂與分化作用，與NAA同時使用，有利于提高分化頻率。（3）在超凈工作臺上，將步驟（2）中得到的芽接入生根培養基中培養，7d時芽的下端出現突起，12～16d開始長根，45～50d根長約為1.0cm；所述生根培養基為：1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA1.0mg/L+KT0.4mg/L，pH6.0；該培養基中的NAA具有誘導不定根的作用，IBA具有促進不定根的生長，兩生長素使用具協同作用，提高根的數量和質量，KT具有促進細胞橫向增粗，使苗粗壯，與生長素同時使用提高苗的質量。（4）上午9～11點，在超凈工作臺上，將步驟（3）中的白及小苗小心取出，放在滅菌過的盤子里，切下0.5～1.0cm長的根尖，將根尖立即放入預處理液中，處理3h，將小苗上剩余的根系切除，再接入生根培養基中培養，并將根尖與小苗編號；所述的預處理液為：0.1%秋水仙素溶液。（5）將步驟（4）中的預處理液中的根尖取出，用蒸餾水清洗后以卡諾氏固定液固定3h，將固定好的根尖用蒸餾水清洗，放入盛有1N鹽酸（濃鹽酸：水=1：11）的小燒杯中，在60℃左右的水浴鍋中處理15～20min，水浴完畢后蒸餾水清洗，切除根冠，留下根尖分生區，以改良品紅染色20min，將染色后的根尖分生區置于干凈載玻片上，加入一滴蒸餾水，將根尖弄碎，蓋上玻片后再加蓋一張吸水紙用大拇指輕壓，最后敲擊直到根尖分散成霧狀；（6）將步驟（5）中做好的載玻片的根尖在顯微鏡下鏡檢，將染色體數量為64條的小苗的編號和數量記錄下來；統計白及四倍體誘導率為2.6%～23.4%。通過查閱資料得知，白及二倍體的染色體數為32條，所以染色體為64條的小苗為四倍體植株。所述愈傷組織增殖培養、分化培養及生根培養階段的培養條件是：培養溫度為25±3℃，光照時間為12h/d，光照強度為1500Lx。所述培養基中，MS和N6均為基本培養基，2,4-D為2,4-二氯苯氧乙酸，6-BA為芐氨基嘌呤，TDZ為噻重氮苯基脲，IBA為吲哚-3-丁酸，NAA為a-萘乙酸，ZT為玉米素，KT為激動素，試劑均為分析純，水為蒸餾水。所述化學誘導劑中，DMSO為二甲基亞砜，水為蒸餾水。本專利技術利用白及愈傷組織進行白及四倍體誘導。愈傷組織是外植體的增生細胞產生的一團不規則、疏松的薄壁細胞，細胞增殖速度快，在培養基的作用下具有很強的分生能力和再分化能力，因此，在培養期間，大量細胞處于分裂期。化學誘導劑由秋水仙素和DMSO組成，DMSO具有極強的滲透性，有助于藥物向細胞中滲透，同時也是滲透性的保護劑，改變生物膜對毒性物質的通透性，利于有毒物質的排泄。利用化學誘導劑對愈傷組織進行短時間誘導處理，既可以提高四倍體的誘導率，又能減少化學誘導劑對細胞毒害作用。根據細胞全能性原理，再分化過程中，一個細胞分化為一個植株，可有效減少雜合體的發生。因此，該方法具有操作簡單、易控制、重復性好、誘導率高、多倍體的純化率好等優點。附圖說明圖1為本專利技術實施例1～3中白及四倍體染色體數目顯微放大示意圖2n=4x=64。具體實施方式下面結合實施例對本
技術實現思路
作進一步的說明，但不是對本專利技術的限定。實施例1一種以愈傷組織誘導白及四倍體的方法，包括以下步驟：（1）在超凈工作臺上，將愈傷組織切分成0.3cm×0.3cm的小塊，接入增殖培養基中培養10d；在無菌條件下，往培養瓶中加入滅菌過的化學誘導劑，化學誘導劑浸泡愈傷組織24h；所述的化學誘導劑為：0.05%秋水仙素+3%DMSO；所述增殖培養基為：N6+2,4-D1.0mg/L+NAA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L，pH6.0；（2）在超凈工作臺上，將步驟（1）中的愈傷組織取出，放入無菌水中清洗5次，在無菌濾紙上吸干水，接入分化培養基中培本文檔來自技高網...

【技術保護點】
以愈傷組織誘導白及四倍體的方法，其特征是包括以下步驟：（1）在超凈工作臺上，將白及愈傷組織切分成0.3cm×0.3cm的小塊，接入增殖培養基中培養10?d；在無菌條件下，往培養瓶中加入滅菌過的化學誘導劑，化學誘導劑浸泡愈傷組織8～24?h；所述的化學誘導劑為：0.05～0.2%秋水仙素+3%DMSO；所述增殖培養基為：N6+2,4?D?1.0?mg/L+NAA?0.5?mg/L+TDZ?0.5?mg/L，pH6.0；（2）在超凈工作臺上，將步驟（1）中的愈傷組織取出，放入無菌水中清洗，用無菌濾紙吸干水，接入分化培養基中培養培養，22～30?d產生芽點，36～43?d形成芽，55～65?d芽長出2～3片葉，芽粗壯，葉色深綠色；所述分化培養基為：MS+6?BA?1.0?mg/L+ZT?0.5?mg/L+NAA0.5?mg/L，pH6.0；（3）在超凈工作臺上，將步驟（2）中得到的芽接入生根培養基中培養，7?d時芽的下端出現突起，12～16?d開始長根，45～50?d根長為1.0?cm；所述生根培養基為：1/2MS+NAA?0.5?mg/L+IBA?1.0?mg/L+KT?0.4?mg/L，pH6.0；（4）上午9～11點，在超凈工作臺上，將步驟（3）中得到的白及小苗取出，放在滅菌過的盤子里，切下0.5?1.0?cm長的根尖，將根尖立即放入預處理液中，處理3?h，將小苗上剩余的根系切除，再接入生根培養基中培養，并將根尖與小苗編號；所述的預處理液為：0.1%秋水仙素溶液；（5）將步驟（4）中的預處理液中的根尖取出，用蒸餾水清洗后以卡諾氏固定液固定3?h，將固定好的根尖用蒸餾水清洗，放入盛有1N鹽酸的小燒杯中，在55?65℃的水浴鍋中處理15～20?min，水浴完畢后蒸餾水清洗，切除根冠，留下根尖分生區，以改良品紅染色20?min，將染色后的根尖分生區置于干凈載玻片上，加入一滴蒸餾水，將根尖弄碎，蓋上玻片后再加蓋一張吸水紙用大拇指輕壓，最后敲擊直到根尖分散成霧狀；（6）將步驟（5）中做好的載玻片的根尖在顯微鏡下鏡檢，將染色體數量為64條的小苗的編號和數量記錄下來；統計白及四倍體誘導率為2.6%～23.4%。...

【技術特征摘要】
1.以愈傷組織誘導白及四倍體的方法，其特征是包括以下步驟：
（1）在超凈工作臺上，將白及愈傷組織切分成0.3cm×0.3cm的小塊，接入增殖培養基中培養10d；在無菌條件下，往培養瓶中加入滅菌過的化學誘導劑，化學誘導劑浸泡愈傷組織8～24h；
所述的化學誘導劑為：0.05～0.2%秋水仙素+3%DMSO；
所述增殖培養基為：N6+2,4-D1.0mg/L+NAA0.5mg/L+TDZ0.5mg/L，pH6.0；
（2）在超凈工作臺上，將步驟（1）中的愈傷組織取出，放入無菌水中清洗，用無菌濾紙吸干水，接入分化培養基中培養培養，22～30d產生芽點，36～43d形成芽，55～65d芽長出2～3片葉，芽粗壯，葉色深綠色；
所述分化培養基為：MS+6-BA1.0mg/L+ZT0.5mg/L+NAA0.5mg/L，pH6.0；
（3）在超凈工作臺上，將步驟（2）中得到的芽接入生根培養基中培養，7d時芽的下端出現突起，12～16d開始長根，45～50d根長為1.0cm；
所述生根培養基為：1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：石云平，蘇祖祥，韋紹龍，林茜，李小泉，
申請(專利權)人：廣西壯族自治區農業科學院生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：廣西;45