霍亂弧菌熒光PCR檢測試劑盒制造技術

本發明專利技術涉及一種采用實時熒光PCR方法特異性檢測樣品中霍亂弧菌01型和0139型核酸存在的寡核苷酸序列組合，以及包括該組合的試劑盒。利用本發明專利技術的試劑盒，可快速檢測樣品中是否存在霍亂弧菌01和0139型核酸。該試劑盒對霍亂弧菌核酸的檢測限為10拷貝每反應體系，整個反應可在3-4小時內完成，在疾病監測、臨床診斷等領域具有重要的應用價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種采用實時熒光PCR方法特異性檢測樣品中霍亂弧菌（O1群和O139群）核酸的試劑盒，屬于霍亂弧菌的體外診斷領域。
技術介紹
霍亂弧菌（Vibriocholerae）是革蘭氏陰性菌，菌體如弧狀，一端有鞭毛；霍亂弧菌有耐熱的O抗原，根據O抗原的不同，分成139個血清型，其中O1群和O139型能引起霍亂流行。霍亂主要為小腸疾患，人是霍亂弧菌的唯一易感者，經口感染，通過胃到達小腸，借助鞭毛的運動穿透粘膜層，依靠菌毛等黏附因子黏附于黏膜細胞表面，在此繁殖并產生霍亂腸毒素。霍亂腸毒素致病機理如下：毒素由A和B兩個亞單位組成，A亞單位又分為A1和A2兩個肽鏈，兩者依靠二硫鍵連接；A亞單位為毒性單位，其中A1肽鏈具有酶活性，A2肽鏈與B亞單位結合參與受體介導的內吞作用中的轉位作用；B亞單位為結合單位，能特異地識別腸上皮細胞上的受體；1個毒素分子由一個A亞單位和4-6個B亞單位組成多聚體。霍亂腸毒素作用于腸細胞膜表面上的受體（由神經節苷脂GM1組成），其B亞單位與受體結合，使毒素分子變構，A亞單位進入細胞，A1肽鏈活化，進而激活腺苷環化酶（AC），使三磷酸腺苷（ATP）轉化為環磷酸腺苷（cAMP），細胞內cAMP濃度增高，導致腸粘膜細胞分泌功能大為亢進，使大量體液和電解質進入腸腔而發生劇烈吐瀉，由于大量脫水和失鹽，可發生代謝性酸中毒，血循環衰竭，甚至休克或死亡。在檢測中，PCR法由于其快速簡便的特點逐漸呈現出要替代以細菌培養和血清學檢測為主的傳統檢測方法的趨勢。而對于PCR方法來說，引物的特異性是其檢測特異性和敏感性的基礎。本專利技術分別針對霍亂弧菌O1群和O139群基因序列的保守區域特異的靶序列設計引物和Taqman探針，利用real-timePCR的方法，用來快速檢測樣品中是否存在霍亂弧菌O1群和O139群的核酸。
技術實現思路
本專利技術主要解決的技術問題是快速準確地檢測樣品中是否存在霍亂弧菌（O1群和O139群），提供一種特異性檢測白喉棒狀桿菌的熒光PCR試劑盒。本專利技術所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：一種特異性檢測樣品中霍亂弧菌核酸的試劑盒，包括PCR反應液、酶混合液、陰性質控品和陽性質控品。其中PCR反應液主要含有上述的引物和探針、反應緩沖液、Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有熱啟動Taq酶，陰性質控品為無RNase和DNase水，陽性質控品為含O1和O139群霍亂弧菌特異性擴增位點的重組質粒。PCR反應液中用于核酸擴增的引物為P1和P2，P1-1和P1-2為針對霍亂弧菌O1群基因組特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物，P2-1和P2-2為針對霍亂弧菌O139群基因組特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物；PCR反應液中用于熒光信號監測的寡核苷酸探針為Probe1、2，Probe1為針對霍亂弧菌O1群基因組特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性探針，Probe2為針對霍亂弧菌O139群基因組特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性探針，其中Probe1熒光報告基團X1為FAM，熒光淬滅基團Y1為Eclipse，Probe2熒光報告基團X2為CY5，熒光淬滅基團Y2為BHQ（見表1）。表1檢測霍亂弧菌的引物和探針序列本專利技術的另一個目的是提供本熒光PCR檢測試劑盒在檢測霍亂弧菌的應用方法，包括：試劑盒選用的PCR反應體系為20μl，包括2×PCR緩沖液10μl、10mmol/LdNTP1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探針0.2μl、熱啟動Taq酶混合液0.4μl、樣品DNA2μl，加滅菌水至終體系20μl。試劑盒的PCR反應循環參數為94℃，2min；進入循環階段：94℃變性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反應40個循環。質量控制：每次實驗應設立陰、陽性對照，陰性對照無Ct值（或Ct值為0），陽性對照Ct值≤30，否則實驗結果不成立。結果判讀：陽性：出現“S”型擴增曲線，Ct值≤35；可疑：出現“S”型擴增曲線，但Ct值＞35；陰性：沒有出現“S”型擴增曲線，或者曲線雖然超過了閾值，但不呈“S”型；對可疑結果，應重復實驗，如果重復實驗還是出現“S”型擴增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性。樣本要求：臨床樣本類型包括患者腹瀉標本和分離培養物；臨床樣本采集后應帶冰運輸，-20℃保存，不能反復凍融；從臨床樣本提取DNA，建議采用性能穩定可靠的商品化試劑盒，具體方法參見相應商品化試劑盒說明書，提取的DNA應立即檢測，否則，應將DNA分裝后-80℃～-20℃保存。本專利技術提供的試劑盒具有很好的特異性，可以用于霍亂弧菌的定性檢測，同時可以區分O1和O139血清群，但不能檢出非霍亂弧菌病原體的核酸；對霍亂弧菌核酸O1群和O139群的檢測下限均為100拷貝每反應體系；只需2小時即可完成檢測，可為霍亂弧菌的疾病監測和臨床診斷提供實驗依據。附圖說明圖1和圖2分別為單重實時熒光PCR檢測霍亂弧菌O1群和O139群陽性標準品的擴增曲線圖。從左至右的每組曲線對應濃度依次為2×107-2×103copies/μl，試劑盒對霍亂弧菌的檢測限均為100拷貝每反應體系。橫坐標為反應循環數，縱坐標為不同循環數熒光檢測信號的ΔRn值。圖3為雙重實時熒光PCR檢測體系檢測10種細菌基因組DNA的擴增曲線圖。10種細菌包括：霍亂弧菌和9種陰性對照微生物。霍亂弧菌出現S型擴增曲線，而其他9種病原微生物未出現S型擴增曲線。具體實施方式下面結合具體實施例詳細說明本專利技術的優選實施方式。需要指出的是，這里列出的實施例僅僅為示例性說明的目的，而不應將其解釋為對本專利技術范圍的任何限制。其中使用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實施例中具體選擇的試劑，應理解，本領域技術人員可根據需要選擇其他公司的相應試劑以實現本專利技術的目的。引物和TaqMan探針的設計與合成利用Blast工具對Genbank和國內外文獻中的霍亂弧菌O1和O139血清群基因組序列進行分析，分別選擇其穩定的保守區域作為檢測靶序列。霍亂弧菌O1群檢測靶序列為酰基輔酶A還原酶基因，霍亂弧菌O139群檢測靶序列為ORF71x8基因；并針對檢測靶序列設計和合成引物和探針（見表1）。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生物公司合成，霍亂弧菌O1群的檢測探針5’端標記FAM熒光基團，3’端標記Eclipse熒光淬滅基團；霍亂弧菌O139群的檢測探針5’端標記CY5熒光基團，3’端標記BHQ熒光淬滅基團。檢測菌種的準備本實施例中所使用的霍亂弧菌以及其他陰性對照菌株（副溶血弧菌，鼠疫耶爾森菌，小腸結腸炎耶爾森菌，痢疾志賀菌，福氏志賀菌，大腸桿菌，大腸埃希菌，沙門氏菌，鮑氏志賀菌菌）均購買于中國藥品生物制品檢定所。菌株DNA的抽提選用Qiagen公司QIAampDNAMiniKit（貨號：51306）提取菌株DNA。具體步驟參考試劑盒操作說明書。引物和探針的篩選采用設計的引物和探針檢本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于特異性檢測樣品中霍亂弧菌核酸的試劑盒，同時用于定性區分O1和O139群，其中包括PCR反應液、酶混合液、陰性質控品和陽性質控品；PCR反應液中用于核酸擴增反應的引物序列如下：P1?1：5`??ata?ttg?atc?cga?caa?gcc?caa?atg??3`，P1?2：5`??cga?tgt?tga?ggc?gaa?gtt?tag?g??3`，P2?1：5`??tga?tgt?tgt?ggg?ata?agc?aat?ctt??3`，P2?2：5`??ctc?agc?aat?gcg?gtg?gtc?ta??3`，PCR反應液中用于熒光信號監測的寡核苷酸探針的序列如下：Probe1：5`?X1??cgc?cgc?aat?acg?agc?ccc?aag?gt??Y1??3`，Probe2：5`?X2??aa?ccc?gcc?ctt?cta?atg?aac?acg?cca??Y2??3`，Probe1熒光報告基團X1為FAM，熒光淬滅基團Y1為Eclipse，Probe2熒光報告基團X2為CY5，熒光淬滅基團Y2為BHQ。

【技術特征摘要】
1.一種用于特異性檢測樣品中霍亂弧菌核酸的試劑盒，同時用于定性區分O1和O139群，其中包括PCR反應液、酶混合液、陰性質控品和陽性質控品；PCR反應液中用于核酸擴增反應的引物序列如下：
P1-1：5`-atattgatccgacaagcccaaatg-3`，
P1-2：5`-cgatgttgaggcgaagtttagg-3`，
P2-1：5`-tgatgttgtgggataagcaatctt-3`，
P2-2：5`-ctcagcaatgcggtggtcta-3`，
PCR反應液中用于熒光信號監測的寡核苷酸探針的序列如下：
Probe1：5`-X1-cgccgc...

【專利技術屬性】
技術研發人員：不公告發明人，
申請(專利權)人：江蘇和創生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32