一種愛啡肽的合成方法技術

本發明專利技術提供一種液相制備多肽藥物愛啡肽的方法。該方法包括：以Fmoc-Pro-OH和H-Cys(Mmt)-NH-Dmcp制備中間體；按照愛啡肽的肽序，在中間體上依次偶聯-Trp(Trt)、-Asp(OtBu)、-Gly、-HArg(Pbf)、-Mpa(Mmt)；加入包含脫保護基團試劑的混合溶液反應；加入氧化劑制備愛啡肽。在所述方法中，各偶聯步驟反應結束后僅進行洗滌處理，無需分離純化。該方法合成條件溫和、工藝簡單且工藝穩定，適合工業化連續生產。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及多肽藥物技術制備領域，尤其涉及液相制備多肽藥物愛啡肽的方法。
技術介紹
血栓性疾病是一種常見的心血管疾病，是由血栓引起的血管腔狹窄與閉塞，使主要臟器發生缺血和梗死而引發機能障礙的各種疾病，常表現為心肌梗死、缺血性腦梗死和靜脈血栓栓塞。它可以累及全身各個器官及系統，其發病率、致殘率和病死率都很高。每年大約有0.3％的人發生不同形式的血栓性疾病，嚴重威脅人類健康。目前，臨床上治療血栓性疾病的藥物主要分為抗血小板類藥物、溶血栓藥和抗凝藥三大類。其中，抗血小板類藥物是指一類具有抑制血小板粘附、聚集和釋放功能的藥物，通過抑制血小板凝聚，從而防止血栓形成，可以有效防止心腦血管疾病的發生，并可延長患者的生存期，這類藥物包括阿司匹林、雙嘧達莫、前列環素、噻氯匹定、血小板膜gpIIb/IIIa受體拮抗劑、二磷酸腺苷受體拮抗劑、奧扎格雷、氯吡格雷等。其中血小板膜gpIIb/IIIa受體拮抗劑可通過抑制血小板膜gpIIb/IIIa受體與纖維蛋白的結合，從而起到抑制血小板凝聚的作用。愛啡肽是血小板膜gpIIb/IIIa受體拮抗劑藥物之一，是一種分子七肽，其包括修飾過的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，具有高度選擇性，在阻斷受體后能迅速分解，具有抗血小板作用強、起效快、不良反應少等優點，有很好的市場前景。愛啡肽，又名依非巴特、埃替非巴肽，英文名：Eptifibatide，分子式：C35H49N11O9S2，CAS登錄號148031-34-9，其結構為其中，Mpa-為巰基丙氨酸、HArg-為高精氨酸、Gly-為甘氨酸、Asp-為天冬氨酸、Trp-為色氨酸、Pro-為脯氨酸、Cys-為半胱氨酸。該藥物是由美國CORTherapeuties公司與美國Schering-Plough公司共同研制開發。1998年7月由Schering-Plough公司以商品名Intrifiban在美國首次上市，1999年以商品名Intrifiban在歐洲上市。關于愛啡肽的制備方法，國內外已有專利報道，大體分為固相合成法(中國專利200910104994、中國專利201310263341)、液相合成法(美國專利US20060036071、中國專利200910101647)和固液相結合法(中國專利200910153416、中國專利201210179064和美國專利US20060276626)。其中固相合成法和固液結合法因為需要使用樹脂，特別是Sieber樹脂比較昂貴，所以生產成本較高。美國專利US20060036071公開了一種液相合成愛啡肽的方法。先液相制備三肽片段Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH，再在液相中依次偶聯Gly、Harg得到五肽片段Fmoc-Harg-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH，然后C端連接Cys(Npys)-NH2得到六肽片段，六肽片段與Mpa形成分子間二硫鍵得到中間體：Fmoc-Harg-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(NH.sub.2)-Mpa，再脫除Harg氨基的保護基，最后分子內酰胺鍵成環得到目的產物愛啡肽。采用此種合成方法制備愛啡肽，工藝非常繁瑣，各個片段先要分別制備純化，導致總收率很低.此外，有一步中間體需要用到鈀碳高壓氫化脫掉芐基保護基得到，對設備的要求較高，十分不利于產業化。中國專利200910101674公開了另一種液相合成方法。技術方案是：1.采用Trt-Mpa-OH和H-Lys(Fmoc)-Ome為原料合成二肽，脫去Fmoc保護基后運用金屬有機催化的方法與Boc保護的硫脲進行胍基化反應后水解得到二肽偶聯物Trt-Mpa-Harg(Boc)2-OH；2.按照Fmoc氮端保護策略液相多肽合成H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(P1)-NH2片段，其中P1為Trt及Acm保護基；3.將Trt-Mpa-Harg(Boc)2-OH和H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boe)-Pro-Cys(P1)-NH2片段縮合得到全保護七肽Trt-Mpa-Harg(Boc)2-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boe)-Pro-Cys(P1)-NH2；4.全保護七肽脫去保護基后氧化成環得到愛啡肽粗品；5.愛啡肽粗品經過純化凍干制得純品愛啡肽。此條路線中，每個中間體都需要柱層析或者重結晶純化，費時費力；并且在制備中間體Trt-Mpa-Harg(Boc)2-OH時，要求使用有毒的重金屬試劑HgCl，這在控制重金屬的限度方面非常困難，也不利于環保要求。上述兩條路線都是在液相中使用了匯聚式的方法合成愛啡肽，工藝非常繁瑣，不利于工業化生產。因此提供一種合成條件溫和、工藝簡單、無需分離純化中間體且穩定、適合工業化連續生產的制備方法具有重要的現實意義。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種愛啡肽的液相制備方法，該方法合成條件溫和、工藝簡單且工藝穩定，適合工業化連續生產。本專利技術提供了一種愛啡肽的制備方法，包括以下步驟：1)以Fmoc-Pro-OH和H-Cys(Mmt)-NH-Dmcp制備中間體1：H-Pro-Cys(Mmt)-NH-Dmcp；2)向中間體1中加入Fmoc-Trp(Trt)-F制備中間體2：H-Trp(Trt)-Pro-Cys(Mmt)-NH-Dmcp；3)向中間體2中加入Fmoc-Asp(OtBu)-F制備中間體3：H-Asp(OtBu)-Trp(Trt)-Pro-Cys(Mmt)-NH-Dmcp；4)向中間體3中加入Fmoc-Gly-F制備中間體4：H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Trt)-Pro-Cys(Mmt)-NH-Dmcp；5)向中間體4中加入Fmoc-HArg(Pbf)-F制備中間體5：H-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Trt)-Pro-Cys(Mmt)-NH-Dmcp；6)向中間體5中加入Mpa(Mmt)-OH制備中間體6：Mpa(Mmt)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Trt)-Pro-Cys(Mmt)-NH-Dmcp；7)通過加入包含脫保護基團試劑的混合溶液制備中間體7：HS-Mpa-HArg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(SH)-NH2；8)通過加入氧化劑制備得到愛啡肽。在步驟1-6)中，反應結束后，使用磷酸鹽緩沖液作為洗滌液進行洗滌處理，所得的各中間體不經分離、純化，直接進行下一步反應。其中，所述磷酸鹽緩沖液優選磷酸二氫鈉緩沖液，其濃度為5-30重量％，優選10重量％；其pH＝4-6，優選pH＝5.5。在步驟7)中，所述包含脫保護基團試劑的混合物溶液包括TFA、H2O、EDT、PhOMe，各組分的體積比為TFA∶H2O∶EDT∶PhOMe＝92∶2∶2∶4。本專利技術的方法優選還包括通過反相色譜純化上述步驟8)獲得的愛啡肽的步驟。在本專利技術的方法中，將反應原料依次加入到反應瓶中，待上一步偶聯反應結束后，僅經過簡單的洗滌步驟，即可再加入新的原料，與上一步反應的產物(中間體)進行偶聯反應，各反應的產物(中間體)無需分離、純化；隨后脫去保護基團、氧化制備愛啡肽，并優選通過反相色譜制備愛啡肽精制品，純度大于99％。這種策略不僅本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種愛啡肽的制備方法，包括以下步驟：1)以Fmoc?Pro?OH和H?Cys(Mmt)?NH?Dmcp制備中間體(1)：H?Pro?Cys(Mmt)?NH?Dmcp；2)向中間體(1)中加入Fmoc?Trp(Trt)?F制備中間體(2)：H?Trp(Trt)?Pro?Cys(Mmt)?NH?Dmcp；3)向中間體(2)中加入Fmoc?Asp(OtBu)?F制備中間體(3)：H?Asp(OtBu)?Trp(Trt)?Pro?Cys(Mmt)?NH?Dmcp；4)向中間體(3)中加入Fmoc?Gly?F制備中間體(4)：H?Gly?Asp(OtBu)?Trp(Trt)?Pro?Cys(Mmt)?NH?Dmcp；5)向中間體(4)中加入Fmoc?HArg(Pbf)?F制備中間體(5)：H?HArg(Pbf)?Gly?Asp(OtBu)?Trp(Trt)?Pro?Cys(Mmt)?NH?Dmcp；6)向中間體(5)中加入Mpa(Mmt)?OH制備中間體(6)：Mpa(Mmt)?HArg(Pbf)?Gly?Asp(OtBu)?Trp(Trt)?Pro?Cys(Mmt)?NH?Dmcp；7)通過加入包含脫保護基團試劑的混合溶液制備中間體(7)：HS?Mpa?HArg?Gly?Asp?Trp?Pro?Cys(SH)?NH2；8)通過加入氧化劑制備愛啡肽；其中，在所述步驟1?6)中，反應結束后僅進行洗滌處理，不經分離、純化中間體，直接進入下一步反應。...

【技術特征摘要】
1.一種愛啡肽的制備方法，包括以下步驟：1)以Fmoc-Pro-OH和H-Cys(Mmt)-NH-Dmcp制備中間體(1)：H-Pro-Cys(Mmt)-NH-Dmcp；2)向中間體(1)中加入Fmoc-Trp(Trt)-F制備中間體(2)：H-Trp(Trt)-Pro-Cys(Mmt)-NH-Dmcp；3)向中間體(2)中加入Fmoc-Asp(OtBu)-F制備中間體(3)：H-Asp(OtBu)-Trp(Trt)-Pro-Cys(Mmt)-NH-Dmcp；4)向中間體(3)中加入Fmoc-Gly-F制備中間體(4)：H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Trt)-Pro-Cys(Mmt)-NH-Dmcp；5)向中間體(4)中加入Fmoc-HArg(Pbf)-F制備中間體(5)：H-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Trt)-Pro-Cys(Mmt)-NH-Dmcp；6)向中間體(5)中加入Mpa(Mmt)-OH制備中間體(6)：Mpa(Mmt)-HArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Trt)-Pro-Cys(Mmt)-NH-Dmcp；7)通過加入包含脫保護基團試劑的混合溶液制備中間體(7)：HS-Mpa-HArg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(SH)-...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳學明，袁慧星，宓鵬程，陶安進，袁建成，
申請(專利權)人：深圳翰宇藥業股份有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44