一種檢測人類ABCC4基因多態性的試劑盒及其應用制造技術

本發明專利技術涉及一種檢測人類ABCC4基因多態性的試劑盒及其應用。本發明專利技術盒體內的物質包括檢測ABCC4基因上的rs868853號SNP位點的特異性引物及特異性熒光探針、Taq?DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水。本發明專利技術克服了以往各種基因突變檢測方法存在的各自缺陷。本發明專利技術檢測準確性高、檢測簡單方便、檢測時間短、結果分析簡單的優點，適合臨床實驗室使用，能夠對CYP2C19基因多態性位點進行定性檢測，根據SNP位點進行PCR熒光擴增反應，只需根據兩種不同的熒光曲線是否起線就能進行結果判斷，不會產生人為誤差，假陽性和假陰性率低，提高效率降低檢測成本。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物醫學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術，特別涉及一種檢測人類ABCC4基因多態性的試劑盒及其應用。
技術介紹
ABCC4(ATP-bindingcassettetransporterfamilyclassC4，ABCC4)是ABC蛋白家族成員，定位于染色體13q32，長312kb，含有31個外顯子，編碼1325個氨基酸[6]。ABCC4的結構在ABCC家族中具有一定的特異性，它缺失N端的一個跨膜結構域，只有兩個跨膜結構域，形成MSD1-NBD1-MSD2-NBD2的結構，是ABC家族中結構最簡單的蛋白。ABCC4主要參與轉運機體物質代謝中產生的有機陰離子和一些異型生物質等生物學功能。ABCC4基因上的rs868853號SNP位點多態性主要涉及抗逆轉錄病毒類藥物、抗生素類藥物、心血管疾病藥物、自身免疫疾病類藥物，以及抗腫瘤藥物等。在本專利技術作出之前，目前進行基因突變檢測的方法有數十種。金標準法為基因測序法。基因測序法是目前應用最廣泛、較準確的一種方法，但是該方法需要昂貴的儀器設備和專業的人員進行操作，費時費力，在臨床上很難進行推廣。基因芯片法具有快速高通量的優點，但是操作上復雜，步驟多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段長度多態性(RFLP)檢測基因突變的方法具有成本低廉的優點，但是過程煩瑣，時間長也不適合普及。
技術實現思路
本專利技術的目的就在于克服上述缺陷，研制一種檢測人類ABCC4基因多態性的試劑r>盒及其應用。本專利技術的技術方案是：一種檢測人類ABCC4基因多態性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內的物質，其特征在于：所述盒體內的物質包括檢測ABCC4基因上的rs868853號SNP位點的特異性引物及特異性熒光探針、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水；所述特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：正義引物：5’-CCTTTCTTGGCTCTAAGACTGGA-3’，反義引物：5’-CACCACGCCCGACCAA-3’；所述特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：野生型探針：5’-FAM-CCTCATCTATAAAATAAGGATAA-MGB-3’突變型探針：5’-HEX-CCTCATCTATAAAGTAAGGATA-MGB-3’。所述盒體中各物質的含量為：濃度為10μM的特異性引物共0.45μl，其中正義引物和反義引物各0.225μl；濃度為5μM的特異性熒光探針共0.2μl，其中野生型探針和突變型探針各0.1μl；濃度為5單位/μl的TaqDNA聚合酶0.02μl；濃度為20mM的dNTP混合液0.1μl；濃度為25mM的MgCl2溶液0.5μl；5X熒光定量PCR反應緩沖液2μl；去離子水4.73μl。所述特異性引物中，正義引物的Tm值為59.6℃，反義引物的Tm值為58.8℃；所述特異性熒光探針中，野生型探針的Tm值為67℃，突變型探針的Tm值為67℃。所述試劑盒的保存溫度為-20℃。本專利技術的另一技術方案是：一種檢測人類ABCC4基因多態性的試劑盒的應用，其主要技術物征在于：所述試劑盒用于檢測ABCC4基因上的rs868853號SNP位點的基因型。本專利技術與現有技術相比，優點在于檢測準確性高、檢測簡單方便、檢測時間短、結果分析簡單的優點，適合臨床實驗室使用：(1)利用本專利技術試劑盒能夠對CYP2C19基因多態性位點進行定性檢測，根據SNP位點進行PCR熒光擴增反應，只需根據兩種不同的熒光曲線是否起線就能進行結果判斷，不會產生人為誤差，假陽性和假陰性率低，提高效率降低檢測成本。(2)無需DNA提取，只需裂解全血細胞，將細胞裂解后的懸液加入反應體系即可完成擴增，免去DNA提取的步驟和成本并避免氣溶膠污染，提高檢測效率和準確度，縮短檢測時間。(3)本專利技術試劑盒所使用的熒光檢測探針為Taqman探針，該探針費用低廉；同時本專利技術所有的反應全程閉管操作，PCR反應后不需要進行PCR產物純化、電泳、酶切、雜交等，在節省了檢測成本的同時，大大縮短了檢測周期，提高了檢測的效率，另外降低了PCR產物污染引起假陽性的風險。附圖說明圖1——是ABCC4基因rs1045642號SNP位點-純合野生型擴增曲線示意圖。圖2——是ABCC4基因rs1045642號SNP位點-雜合型擴增曲線示意圖。圖3——是ABCC4基因rs1045642號SNP位點-純合突變型擴增曲線示意圖。具體實施方式下面對本專利技術的實施例作詳細說明，本實施例在以本專利技術技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本專利技術的保護范圍不限于下述的實施例。一種檢測人類ABCC4基因多態性的試劑盒，試劑盒中包括以下ABCC4基因rs1045642號SNP位點的擴增特異性引物1對及2條特異性熒光探針。用于ABCC4基因rs1045642號SNP位點檢測的特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：正義引物：5’-CCTTTCTTGGCTCTAAGACTGGA-3’，反義引物：5’-CACCACGCCCGACCAA-3’；所述特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：野生型探針：5’-FAM-CCTCATCTATAAAATAAGGATAA-MGB-3’突變型探針：5’-HEX-CCTCATCTATAAAGTAAGGATA-MGB-3’。所述的一種檢測人類ABCC4基因多態性的試劑盒，還包括TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水。所述的野生型特異性熒光探針為Taqman探針，該探針5’端的熒光基團為FAM，3’端的淬滅基團為MGB。所述的突變型特異性熒光探針為Taqman探針，該探針5’端的熒光基團為HEX，3’端的淬滅基團為MGB。試劑盒組成試劑盒的配置成份配合配置，使用時僅需加入樣本即可完成實驗配置，此種配置更為方便快捷，為優選配置。配合反應液成份組成：組成成份體積10μM的特異性引物0.45μl正義引物和反義引物0.225μl5μM的特異性熒光探針0.2μl5單位/μl的TaqDNA聚合酶0.02μl20mM的dNTP混合液0.1μl25mM的MgCl20.5μl5X熒光定量PCR反應緩沖液2μl去離子水4.73μl使用試劑盒的操作步驟步驟1：本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測人類ABCC4基因多態性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內的物質，其特征在于：所述盒體內的物質包括檢測ABCC4基因上的rs868853號SNP位點的特異性引物及特異性熒光探針、Taq?DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水；所述特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：正義引物：5’?CCTTTCTTGGCTCTAAGACTGGA?3’，反義引物：5’?CACCACGCCCGACCAA?3’；所述特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：野生型探針：5’?FAM?CCTCATCTATAAAATAAGGATAA?MGB?3’突變型探針：5’?HEX?CCTCATCTATAAAGTAAGGATA?MGB?3’。

【技術特征摘要】
1.一種檢測人類ABCC4基因多態性的試劑盒，包括盒體和裝于盒體內的物質，其特征在
于：所述盒體內的物質包括檢測ABCC4基因上的rs868853號SNP位點的特異性引物及特異性
熒光探針、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水；
所述特異性引物中的正義引物和反義引物的序列為：
正義引物：5’-CCTTTCTTGGCTCTAAGACTGGA-3’，
反義引物：5’-CACCACGCCCGACCAA-3’；
所述特異性熒光探針包括野生型探針和突變性探針，它們的序列為：
野生型探針：5’-FAM-CCTCATCTATAAAATAAGGATAA-MGB-3’
突變型探針：5’-HEX-CCTCATCTATAAAGTAAGGATA-MGB-3’。
2.如權利要求1所述的一種檢測人類ABCC4基因多態性的試劑盒，其特征在于：所述盒
體中各物質的含量為：濃度為10μM的特異性引物共0....

【專利技術屬性】
技術研發人員：徐運，邵淵，張希根，
申請(專利權)人：南京仁天生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32