抗C-MET串聯(lián)Fc雙特異性抗體制造技術(shù)

本文提供了串聯(lián)Fc和串聯(lián)Fc抗體(“TFcA”)，例如串聯(lián)Fc雙特異性抗體(“TFcBA”)，所述抗體包含與一種或多種細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合的一個(gè)或至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。所述結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)由TFc連接，所述TFc包含第一Fc區(qū)和第二Fc區(qū)，其中所述第一Fc區(qū)和所述第二Fc區(qū)經(jīng)由TFc接頭連接以形成連續(xù)的多肽并且二聚化以形成Fc二聚體。示例性TFcBA與細(xì)胞表面受體c-Met和EpCam結(jié)合并且抑制經(jīng)由一種或多種細(xì)胞表面受體進(jìn)行的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述TFcBA的結(jié)合位點(diǎn)對(duì)所述細(xì)胞表面受體具有特異性。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2013年3月6日提交的美國序列號(hào)61/773,764和2013年3月6日提交的美國序列號(hào)61/773,788的權(quán)益；上述申請(qǐng)全部均以引用的方式整體并入本文。
技術(shù)介紹
已經(jīng)確定的是，腫瘤細(xì)胞表達(dá)刺激細(xì)胞增殖的生長因子和細(xì)胞因子的受體，并且此外，針對(duì)這些受體(例如酪氨酸激酶受體)的抗體可以有效阻斷由生長因子和細(xì)胞因子所介導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞增殖的刺激作用以抑制腫瘤細(xì)胞生長。靶向癌細(xì)胞上的受體的可商購獲得的治療性抗體包括例如用于治療乳腺癌的曲妥珠單抗(trastuzumab)(赫賽汀(Herceptin))，它靶向HER2受體(也被稱為ErbB2)；以及用于治療結(jié)腸直腸癌和頭頸部癌的西妥昔單抗(cetuximab)(愛必妥(Erbitux))，它靶向表皮生長因子受體(EGFR，也被稱為HER1或ErbB1)。雖然這種施用僅包含單一治療性單克隆抗體的治療劑的方法(當(dāng)在沒有施用另一種治療性抗體的情況下施用時(shí)，在本文被稱為單一療法)已經(jīng)在癌癥治療方面顯示出相當(dāng)大的成功，但是存在許多可能導(dǎo)致這種治療失敗或在初始抑制后出現(xiàn)腫瘤生長復(fù)發(fā)的因素。舉例來說，某些腫瘤依賴于超過一種生長因子介導(dǎo)的細(xì)胞增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并且因此，靶向單一通路可以被證實(shí)不足以顯著影響腫瘤細(xì)胞的生長。或者，即使在一種通路是唯一的或主要的生長刺激通路的情況下，某些腫瘤細(xì)胞仍能夠在原始通路被抗體阻斷時(shí)激活另一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以進(jìn)行生長刺激(先天性治療抗性)。更進(jìn)一步，一些腫瘤對(duì)抗體單一療法表現(xiàn)出初始反應(yīng)性，但是隨后通過轉(zhuǎn)變成使用另一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而產(chǎn)生治療抗性(獲得性治療抗性)。此外，一些受體，如c-Met受體由常規(guī)的抗體(例如IgG抗體)刺激以向上面表達(dá)它們的細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。不意圖受任何具體的操作理論所束縛，這種現(xiàn)象被認(rèn)為是由同一細(xì)胞上的兩個(gè)受體通過抗體上存在的配對(duì)的，一般相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行交聯(lián)配對(duì)而產(chǎn)生的，所述抗體諸如IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM。這種刺激可能具有與產(chǎn)生治療益處的作用相反的作用，例如，細(xì)胞的生長和復(fù)制可能由這些抗c-Met抗體上調(diào)，而不是抑制。在實(shí)施方案中，與受體或多種受體(例如c-Met受體)和本專利技術(shù)的組合物的相互作用產(chǎn)生了拮抗劑活性。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，這種相互作用產(chǎn)生了拮抗劑活性并且基本上沒有或沒有激動(dòng)劑活性。在一個(gè)方面，拮抗劑活性對(duì)于抑制癌癥的組合物和方法是有用的。因此，需要另外的用于癌癥治療的治療方法來克服抗體單一療法的限制因素以及提供其它益處。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本文提供了工程抗體，如串聯(lián)Fc抗體(“TFcA”)。示例性TFcA是串聯(lián)Fc雙特異性抗體(TFcBA)，如以下申請(qǐng)中所述的那些：2011年8月26日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/527,802；以及2012年8月27日提交的共同未決的PCT國際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2012/052490(參見國際公開號(hào)WO2013/033008A2)。TFcBA包含串聯(lián)Fc，所述串聯(lián)Fc是包含第一Fc區(qū)和第二Fc區(qū)的多肽部分，所述第一Fc區(qū)和所述第二Fc區(qū)中的每一個(gè)均具有C末端和N末端；所述第一Fc區(qū)和所述第二Fc區(qū)經(jīng)由具有C末端和N末端的TFc接頭連接成單條多肽鏈(即所述第一Fc區(qū)的C末端通過肽鍵與所述TFc接頭的N末端連接，所述TFc接頭的C末端進(jìn)而通過肽鍵與所述第二Fc區(qū)的N末端連接)。TFcBA可以包含至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(至少第一結(jié)合位點(diǎn)和第二結(jié)合位點(diǎn))。每一個(gè)這樣的結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞表面受體的特定部分特異性結(jié)合。示例性細(xì)胞表面受體是由癌細(xì)胞表達(dá)或過表達(dá)的那些細(xì)胞表面受體。示例性結(jié)合位點(diǎn)包括抗體衍生的結(jié)合位點(diǎn)，所述結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞表面受體的細(xì)胞外域免疫特異性結(jié)合。TFcA或TFcBA的第一結(jié)合位點(diǎn)或第二結(jié)合位點(diǎn)可以與選自由以下各項(xiàng)組成的組的人類受體蛋白特異性結(jié)合：ErbB2、ErbB3(例如US7,846,440中所述的結(jié)合位點(diǎn))、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰島素受體、RON、c-Met、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α和β)、c-Kit、EPCAM以及EphA2。一般來說，所述受體將是受體酪氨酸激酶。通常，這種結(jié)合將對(duì)所述受體蛋白的細(xì)胞外部分具有特異性。在本文公開的某些實(shí)施方案中，由TFcBA所包含的至少兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)中的一個(gè)是對(duì)c-Met具有特異性的結(jié)合位點(diǎn)，例如抗c-MetFab或抗cMetscFv。在某些舉例說明的實(shí)施方案中，提供了一種TFcBA，所述TFcBA包含單個(gè)抗c-Met結(jié)合位點(diǎn)和不與c-Met結(jié)合的至少一個(gè)第二結(jié)合位點(diǎn)，例如對(duì)以下各項(xiàng)具有特異性的結(jié)合位點(diǎn)：ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰島素受體、RON、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α和β)、c-Kit、EPCAM以及EphA2，其中所述抗c-Met結(jié)合位點(diǎn)和所述第二結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)由TFc連接以形成連續(xù)多肽。提供了TFcBA，所述TFcBA與單一受體上的兩個(gè)表位(例如細(xì)胞外表位)或兩種不同的細(xì)胞表面受體結(jié)合，并且在這種結(jié)合之后，強(qiáng)烈地抑制通常由與TFcBA結(jié)合的至少一種細(xì)胞表面受體的同源配體所刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。舉例來說，抗c-Met+抗EGFRTFcBA可以抑制由HGF(肝細(xì)胞生長因子，C-met的同源配體)和EGF(表皮生長因子，EGFR的同源配體)中的任何一者或這兩者所誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；或抗c-Kit+抗RONTFcBA可以抑制由巨噬細(xì)胞刺激蛋白(RON的同源配體)和干細(xì)胞因子(c-Kit的同源配體)中的任何一者或這兩者所誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；或抗c-Met+抗EPCAMTFcBA可以抑制由HGF誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并且可以抑制c-Met受體在不存在HGF的情況下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如非配體依賴性c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))；每一種這樣的抑制作用均具有10nM或更小或者1nM或更小或者100pM或更小的IC50，或具有至少70％或至少80％或至少90％的最大抑制百分比，如由對(duì)配體誘導(dǎo)的(或在c-Met在不存在HGF的情況下進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況下，非配體依賴性的)一種或多種受體磷酸化的抑制所指示，所述磷酸化是由TFcBA抑制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在多個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的包含抗c-Met的TFcBA基本上不對(duì)表達(dá)c-Met的細(xì)胞產(chǎn)生刺激作用。在其它實(shí)施方案中，本文提供的包含抗c-Met的TFcBA誘導(dǎo)表達(dá)c-Met的細(xì)胞上的c-Met受體下調(diào)或降解。在其它實(shí)施方案中，本文提供的抗EPCAMTFcBA在表達(dá)低EPCAM水平(少到每個(gè)細(xì)胞100,000個(gè)+/-5％EP本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種串聯(lián)Fc雙特異性抗體(“TFcBA”)，所述抗體包含兩條多肽鏈，即大型鏈和Fab輕鏈，每一條鏈均具有C末端和N末端，所述TFcBA包含第一結(jié)合位點(diǎn)，所述第一結(jié)合位點(diǎn)由Fab部分所包含，所述Fab部分包含所述Fab輕鏈和Fab重鏈，所述Fab重鏈位于所述大型鏈的N末端處，所述Fab部分與cMET特異性結(jié)合，并且所述TFcBA還包含第二結(jié)合位點(diǎn)，所述第二結(jié)合位點(diǎn)由單鏈Fv(scFV)部分所包含，所述scFV部分位于所述大型鏈的C末端處，所述scFv部分與EpCAM特異性結(jié)合，其中：(a)所述Fab重鏈和所述scFv部分經(jīng)由串聯(lián)Fc(“TFc”)連接；(b)所述TFc由所述大型鏈所包含并且具有第一Fc區(qū)和第二Fc區(qū)，所述第一Fc區(qū)和所述第二Fc區(qū)經(jīng)由TFc接頭連接以形成連續(xù)的多肽；以及(c)所述第一Fc區(qū)和所述第二Fc區(qū)締合以形成Fc二聚體，并且進(jìn)一步其中(d)所述Fab輕鏈包含如下的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ?ID?NO:400中所存在的三個(gè)輕鏈CDR；以及(e)所述Fab重鏈包含如下的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ?ID?NO:423中所存在的三個(gè)重鏈CDR。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2013.03.06 US 61/773,764;2013.03.06 US 61/773,7881.一種串聯(lián)Fc雙特異性抗體(“TFcBA”)，所述抗體包含兩條多肽鏈，即大型鏈和Fab輕
鏈，每一條鏈均具有C末端和N末端，所述TFcBA包含第一結(jié)合位點(diǎn)，所述第一結(jié)合位點(diǎn)由Fab
部分所包含，所述Fab部分包含所述Fab輕鏈和Fab重鏈，所述Fab重鏈位于所述大型鏈的N末
端處，所述Fab部分與cMET特異性結(jié)合，并且所述TFcBA還包含第二結(jié)合位點(diǎn)，所述第二結(jié)合
位點(diǎn)由單鏈Fv(scFV)部分所包含，所述scFV部分位于所述大型鏈的C末端處，所述scFv部分
與EpCAM特異性結(jié)合，其中：
(a)所述Fab重鏈和所述scFv部分經(jīng)由串聯(lián)Fc(“TFc”)連接；
(b)所述TFc由所述大型鏈所包含并且具有第一Fc區(qū)和第二Fc區(qū)，所述第一Fc區(qū)和所述
第二Fc區(qū)經(jīng)由TFc接頭連接以形成連續(xù)的多肽；以及
(c)所述第一Fc區(qū)和所述第二Fc區(qū)締合以形成Fc二聚體，并且進(jìn)一步其中
(d)所述Fab輕鏈包含如下的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO:400中所存
在的三個(gè)輕鏈CDR；以及
(e)所述Fab重鏈包含如下的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQIDNO:423中所存
在的三個(gè)重鏈CDR。
2.如權(quán)利要求1所述的TFcBA，其中所述scFV部分包含氨基酸序列SEQIDNO:488。
3.如權(quán)利要求1或2所述的TFcBA，其中所述TFcBA大型鏈按N末端到C末端的順序包含：
(i)所述Fab重鏈可變區(qū)IgG1CH1結(jié)構(gòu)域；
(ii)雜合鉸鏈，所述雜合鉸鏈含有IgG1上部鉸鏈以及IgG4中部鉸鏈和下部鉸鏈；
(iii)包含T299K突變的第一IgG4CH2結(jié)構(gòu)域；
(iv)包含T366S、L368A以及Y407V突變的第一IgG1CH3結(jié)構(gòu)域；
(v)第一二硫橋基序(KSCDKT)；
(vi)串聯(lián)Fc接頭，任選地包含氨基酸序列(G4S)8的接頭；
(vii)IgG4中部鉸鏈和下部鉸鏈；
(viii)包含T299D突變的第二IgG4CH2結(jié)構(gòu)域；
(ix)包含T366W突變的第二IgG1CH3結(jié)構(gòu)域；
(x)第二二硫橋基序(GEC)；
(xi)連接接頭；以及
(xii)所述scFv。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的TFcBA，其中所述TFcBA表現(xiàn)出小于約10e-8M、10e-
9M、10e-10M、10e-11M、10e-12M、或10e-13M的與cMET結(jié)合的Kd。
5.如權(quán)利要求4所述的TFcBA，其中所述TFcBA表現(xiàn)出3.0×10e-8M至2.5×10e-9M的與
cMET結(jié)合的Kd。
6.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的TFcBA，其中所述TFcBA表現(xiàn)出小于約10e-7M或10e-
8M或任選地10e-9M的與EpCAM結(jié)合的Kd。
7.如權(quán)利要求6所述的TFcBA，其中所述TFcBA表現(xiàn)出10e-8M至10e-11M的與cMET結(jié)合的

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：B·哈姆斯，N·科利，A·盧戈維斯科，M·格迪，E·M·克勞蘭德，W·G·羅奇，S·蘇，A·阿布尤西夫，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：梅里麥克制藥股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：美國;US