本發明專利技術涉及一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty-3的InDel標記，該分子標記的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發明專利技術還涉及一種擴增基于番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的InDel標記的引物對，該引物對序列如下：正向引物序列：5’-TGCAGGAACAGAATGATAGAAAA-3’；反向引物序列：5’-GCTCAGCATCACCTGAGACA-3’。本發明專利技術的分子標記完全基于番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3。本發明專利技術開發出基于黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的InDel標記，該標記完全基于抗性基因Ty-3，與Ty-3基因完全連鎖，為共顯性分子標記。將該標記用于黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的分子標記輔助選擇，可大幅提高選擇的準確性，縮短育種年限，從而加速育種進程。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于農業生物技術工程領域，特別涉及一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的InDel分子標記及擴增該分子標記的引物、利用分子標記的檢測方法及其應用。
技術介紹
番茄(SolanumlycopersicumL.)屬于茄科(Solanaceae)，為一年生草本茄科植物。番茄起源于南美西部地區，是世界范圍內廣泛栽培的重要蔬菜作物之一，深受廣大消費者的喜愛。隨著番茄栽培面積的逐年擴大，栽培方式的多樣化，番茄病蟲害問題日趨嚴重，近年來，番茄黃化曲葉病毒病在世界各地保護地番茄種植上普遍發生，給番茄生產帶來巨大經濟損失。因此培育抗黃化曲葉病毒新品種對番茄的生產意義重大。番茄抗TYLCV植株材料先后在Solanumpimpinellifolium、Solanumperuvianum、Solanumchilense、Solanumhabrochaite、Solanumcheesmaniae等野生材料中發現。抗源材料不同，其抗性遺傳規律也不同。目前已發現的抗性基因主要有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-3a、Ty-4、Ty-5，其中Ty-1、Ty-2、Ty-3作為番茄抗TYLCV的主效抗性基因在生產中得以應用(Liedl,etal.,2013)。國內番茄抗黃化曲葉病毒病育種起步較晚，與國外先進國家有較大的差距。由于番茄黃化曲葉病毒變異較大，這使番茄抗番茄黃化曲葉病常規育種進展很慢。與傳統的遺傳育種相比，分子標記有很多優點，尤其是以PCR為基礎的DNA分子標記技術大大加快了育種的進程和效率。目前，已有諸如REX-1(deCastroetal.,2007)、TG0302(Garciaetal.,2007)、P6-25(Jiveark.,2008)和UF_TY3-P23(Verlaan,etal.,2013)等多個與番茄黃化曲葉病毒病抗病基因緊密的連鎖標記被陸續開發出來，并逐步在育種實踐中加以應用。但這些標記均與抗病基因間存在一定的遺傳距離，故篩選時會出現一定比例的假陽性。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty-3的InDel標記。本專利技術的另一目的在于提供該分子標記在番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3檢測以及標記輔助育種中的應用。為了實現本專利技術目的，本專利技術提供了一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty-3的InDel標記，該分子標記的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本專利技術還提供了一種擴增基于番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的InDel標記的引物對，該引物對序列如下：正向引物序列：5’-TGCAGGAACAGAATGATAGAAAA-3’；反向引物序列：5’-GCTCAGCATCACCTGAGACA-3’。本專利技術還提供了一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的InDel標記的檢測方法，該方法以抗感番茄黃化卷葉病毒的番茄基因組DNA為模板經PCR擴增，得到能同時鑒定父本、母本及其雜合體基因型的特異譜帶，該特異譜帶為攜帶抗性基因的植株譜帶和不攜帶抗性基因的植株譜帶，所述攜帶抗性基因Ty-3的植株譜帶為核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的分子標記。所述不攜帶抗性基因Ty-3的植株譜帶的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。上述方法中，PCR反應體系(20μL)為：包括正、反向引物各0.8μM，1.2mMdNTPs，2.5mMMgCl2，2μL10×buffer，0.5unitsTaq聚合酶，DNA模板30-50ng，ddH2O補至20μL。上述方法中，PCR擴增的程序均為：94℃預變性5min；94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s，35個循環；72℃延伸10min；保存溫度4℃。本專利技術還提供了上述分子標記和檢測方法在番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3檢測或標記輔助育種中的應用。有益效果：1)本專利技術的分子標記完全基于番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3。該標記引物的特異性強、穩定性高，并且標記的篩選方法操作簡便快捷，對檢測設備和引物模板質量要求不高，具有試驗試劑用量少，速度快，成本低，適合大批次、高通量、自動化的優點。非常適合現代農業分子育種的實現。2)本專利技術的番茄黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3特異分子標記引物應用于育種工作中，將大大降低番茄黃化曲葉病毒病流行對番茄生產造成的經濟損失，同時減少農藥使用量，有益于降低生產成本，具有很大的應用潛力和較高的經濟價值。3)本專利技術開發出基于黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的InDel標記，該標記完全基于抗性基因Ty-3，與Ty-3基因完全連鎖，為共顯性分子標記。將該標記用于黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的分子標記輔助選擇，可大幅提高選擇的準確性，縮短育種年限，從而加速育種進程。附圖說明本專利技術有如下附圖：圖1為InDel標記(Ty-3-InDel)在感病材料和抗病材料中的部分DNA序列(P2與P1間存在250bp的缺失)；圖2為InDel標記Ty-3-InDel在親本間及F1中的PCR產物檢測結果(1：100bpladder；2-3：感病親本P2；4-5：抗病親本P1；6-7：F1單株)；圖3為InDel標記Ty-3-InDel在F2群體中的檢測(M：D2000；1-48：F2代單株)；圖4為InDel標記Ty-3-InDel在回交群體中的應用(M：D2000；1-48：BC1代單株)。具體實施方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。在不背離本專利技術精神和實質的情況下，對本專利技術方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本專利技術的保護范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1基于Ty-3基因的InDel標記的開發及驗證1.供試材料本試驗所用的抗病自交系P1和感病自交系P2經已知分子標記P6-25檢測證實，P1為抗病純合體(Ty-3/Ty-3)，而P2為感病純合體(ty-3/ty-3)。P1為母本，P2為父本配制雜交組合，得到F1后，再自交得到F2分離群體。2.接種鑒定抗性鑒定采用煙粉虱接種鑒定法，具體參照楊曉慧(2012)的方法。于幼苗2-3片真葉期，將其放置于放有帶毒煙粉虱的生長室內，兩周后殺死帶毒的煙粉虱，之后將苗子移栽到日光溫室或大田中，觀察病情結果。3.InDel分子標記的開發及驗證A、InDel標記的開發Verlaan等(2013)報道Ty-3基因即為Solyc06g051190。登陸SGN(SolGenomics<本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty?3的InDel分子標記，該分子標記的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。
【技術特征摘要】
1.一種基于番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty-3的InDel分子標記，該分子標記的核苷
酸序列如SEQIDNo.1所示。
2.擴增權利要求1所述的分子標記的引物。
3.如權利要求2所述的引物，該引物序列如下：
正向引物序列：5’-TGCAGGAACAGAATGATAGAAAA-3’；
反向引物序列：5’-GCTCAGCATCACCTGAGACA-3’。
4.使用權利要求1所述分子標記的檢測方法，其特征在于，
該方法以抗感番茄黃化曲葉病毒病的番茄基因組DNA為模板經PCR擴增，得到能同時鑒
定父本、母本及其雜合體的基因型的特異譜帶，該特異譜帶為攜帶抗性基因的植株譜帶和
不攜帶抗性基因的植株譜帶，所述攜帶抗性基因的植株譜帶為權利要求1所述的分子標記。
5.如權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述PCR反應體系(20μL)如下：包括正、
反向引物各0.8μM，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王富，王輝，李文麗，董盼盼，
申請(專利權)人：青島農業大學，
類型：發明
國別省市：山東;37
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