光交聯(lián)的形成抑制方法、及自交聯(lián)體形成抑制型光響應(yīng)性核酸技術(shù)

通過將能夠與具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基進(jìn)行光交聯(lián)的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基的、嘧啶環(huán)的5位取代成R基(其中，R為?CN、或?CO?R1，其中，R1為飽和或不飽和的、鏈狀或分支的、環(huán)式或非環(huán)式的C1～C12的烴基)，從而能夠抑制具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基與能夠進(jìn)行光交聯(lián)的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基之間的光交聯(lián)的形成，由此提供一種防止光響應(yīng)性核酸探針失活的手段。

Method for inhibiting formation of cross linking, and formation of inhibitory light responsive nucleic acid by self crosslinking

The light will be able to have light and crosslinked by crosslinking of vinyl photoresponsive base thymine (T) or uracil (U) pyrimidine ring base, 5 substituted into R based (which, for CN, R or CO R1, among them, R1 is saturated or unsaturated the chain shaped or branched, ring or ring type C1 ~ C12), the response of alkyl vinyl base which can inhibit the crosslinking structure with light light light can crosslink and thymine (T) or uracil (U) between the bases of the photocrosslinking formation, thus providing a to prevent the light response of the nucleic acid probe inactivation method.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及抑制具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基與能夠進(jìn)行光交聯(lián)的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基之間形成光交聯(lián)的方法、以及自交聯(lián)體形成抑制型光響應(yīng)性核酸。
技術(shù)介紹
分子生物學(xué)領(lǐng)域的基本技術(shù)包括核酸雙鏈形成和檢測，這不僅是基礎(chǔ)研究，而且已經(jīng)廣泛用于醫(yī)療領(lǐng)域、工業(yè)領(lǐng)域、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域等。作為對于核酸雙鏈形成和檢測特別有用的技術(shù)，有使用了光響應(yīng)性核酸的光交聯(lián)技術(shù)。該光交聯(lián)技術(shù)已經(jīng)有多種應(yīng)用，例如從反義核酸等核酸藥品、SNPs的檢測等醫(yī)療領(lǐng)域擴(kuò)展到使用了核酸的DNA納米
該使用光響應(yīng)性核酸的光交聯(lián)技術(shù)是本專利技術(shù)人的研究組開拓的領(lǐng)域，已經(jīng)開發(fā)了多種光響應(yīng)性人工核苷酸并提出了專利申請(專利文獻(xiàn)1)。作為該光交聯(lián)技術(shù)的特別優(yōu)選的應(yīng)用，有高靈敏度的選擇性核酸擴(kuò)增方法(光鉗夾法)(專利文獻(xiàn)2)。該方法在用PCR進(jìn)行核酸擴(kuò)增前使用光響應(yīng)性核酸作為鉗夾探針，與被檢物中為數(shù)眾多的野生型(或正常型)的堿基序列的核酸進(jìn)行光連結(jié)，形成不能解離的雙鏈，從而對為數(shù)眾多的野生型(或正常型)的堿基序列的核酸進(jìn)行抑制使其無法用PCR擴(kuò)增，結(jié)果能夠高靈敏度、選擇性地對被檢物中的作為目標(biāo)的數(shù)量較少的變異型堿基序列的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:國際公開第2009/066447號專利文獻(xiàn)2:國際公開第2012/033190號
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
專利技術(shù)要解決的問題本專利技術(shù)人的研究組發(fā)現(xiàn)了如下問題：在上述光鉗夾法中，原本應(yīng)作為鉗夾探針起作用的光響應(yīng)性核酸的一部分失去功能、即所謂的失活，鉗夾形成效率有時(shí)會變差。從光響應(yīng)性核酸的高光反應(yīng)效率來看，這種現(xiàn)象本來是不可能出現(xiàn)的。這樣的光響應(yīng)性核酸探針失活不僅僅引起光鉗夾法的效率降低的問題，在光響應(yīng)性核酸探針的全部應(yīng)用中都可能成為問題。因此，本專利技術(shù)的目的在于，提供一種防止光響應(yīng)性核酸探針失活的手段。用于解決問題的方案本專利技術(shù)人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果獲知：上述的光鉗夾法中的光響應(yīng)性核酸探針失活的原因在于，在光響應(yīng)性核酸探針具有可在自身的堿基序列內(nèi)部分地形成雙鏈那樣的堿基序列時(shí)，以在自身的堿基序列內(nèi)形成了雙鏈的狀態(tài)進(jìn)行光交聯(lián)，即，光響應(yīng)性核酸探針形成自交聯(lián)體，從而喪失了原本希望的、與互補(bǔ)鏈形成雙鏈而進(jìn)行光交聯(lián)的能力。作為基于該見解的失活抑制手段，例如有如下手段：預(yù)先避免采用在自身的堿基序列內(nèi)形成雙鏈那樣的堿基序列。但是，這樣的手段會限制光響應(yīng)性核酸探針的應(yīng)用范圍，在欲使用充分長的堿基序列時(shí)是一種特別苛刻的制約。因此，本專利技術(shù)人為了避免這樣的光響應(yīng)性核酸探針的堿基序列的制約進(jìn)行了進(jìn)一步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：作為光響應(yīng)核酸探針的光響應(yīng)性核酸的光連結(jié)對象的堿基即胸腺嘧啶(T)，即使在能夠與互補(bǔ)鏈形成雙鏈的范圍內(nèi)接受各種修飾，也可維持與光響應(yīng)性核酸的光交聯(lián)的形成能力，然而在制成為胸腺嘧啶的5位取代成吸電子性的氰基的5-氰基-2’-脫氧尿苷(CNT)時(shí)，與互補(bǔ)鏈形成雙鏈不受影響，與光響應(yīng)性核酸形成光交聯(lián)的速度變得極小，從而完成了本專利技術(shù)。即，若導(dǎo)入將胸腺嘧啶的5位取代成吸電子性的氰基的5-氰基-2’-脫氧尿苷(CNT)，則能夠抑制光響應(yīng)性核酸探針的失活。此外，根據(jù)該見解，不僅抑制了光響應(yīng)性核酸探針形成自交聯(lián)體所致的失活，還防止了如下情況，因此能夠廣泛加以利用，所述情況為：在其附近具有與光響應(yīng)性堿基附近的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基形成了不希望的光交聯(lián)，結(jié)果導(dǎo)致無法形成所希望的光交聯(lián)；或浪費(fèi)光響應(yīng)性核酸，而使目的反應(yīng)的效率、收率降低。因此，本專利技術(shù)涉及以下的(1)～(9)。(1)一種抑制光交聯(lián)的形成的方法，通過將能夠與具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基進(jìn)行光交聯(lián)的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基的、嘧啶環(huán)的5位取代成R基(其中，R為-CN、或-CO-R1，其中，R1為飽和或不飽和的、鏈狀或分支的、環(huán)式或非環(huán)式的C1～C12的烴基)，來抑制具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基與能夠進(jìn)行光交聯(lián)的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基之間的光交聯(lián)的形成。(2)根據(jù)(1)所述的方法，其中，光交聯(lián)的形成是如下反應(yīng)：位于光響應(yīng)性核酸的堿基序列中的具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基、與位于部分互補(bǔ)性核酸中的該互補(bǔ)性部分堿基序列中的能夠與光響應(yīng)性堿基進(jìn)行光交聯(lián)的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基之間形成光交聯(lián)的反應(yīng)，其中，所述部分互補(bǔ)性核酸是具有與該光響應(yīng)性核酸的堿基序列中的包含光響應(yīng)性堿基的4個(gè)堿基長以上的部分堿基序列(光響應(yīng)性部分堿基序列)互補(bǔ)的部分堿基序列(互補(bǔ)性部分堿基序列)的核酸，所述方法通過使用部分互補(bǔ)性核酸來抑制光響應(yīng)性核酸與部分互補(bǔ)性核酸之間的光交聯(lián)的形成，部分互補(bǔ)性核酸中通過形成磷酸二酯鍵而導(dǎo)入下式(I)所示的修飾核苷酸來代替互補(bǔ)性部分堿基序列中的能夠進(jìn)行光交聯(lián)的T或U的核苷酸中的至少1個(gè)以上，(其中，式I中，R為-CN、或-CO-R1，其中，R1為飽和或不飽和的、鏈狀或分支的、環(huán)式或非環(huán)式的C1～C12的烴基，X表示在式I中與鍵合在X上的O成為一體而形成的磷酸基，Y表示羥基，Z為氫或羥基。(3)根據(jù)(1)～(2)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，光響應(yīng)性核酸將光響應(yīng)性部分堿基序列和互補(bǔ)性部分堿基序列作為同一分子中不同的序列區(qū)域而含有，光響應(yīng)性核酸的分子和部分互補(bǔ)性核酸的分子是同一分子，抑制光響應(yīng)性核酸與部分互補(bǔ)性核酸之間的光交聯(lián)的形成的方法是如下方法：抑制通過光響應(yīng)性堿基與能夠進(jìn)行光交聯(lián)的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基之間的光交聯(lián)而形成光響應(yīng)性核酸的自交聯(lián)體的方法。(4)根據(jù)(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，式(I)中的R為-CN。(5)根據(jù)(1)～(4)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基為具有3-乙烯基咔唑結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基。(6)根據(jù)(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基作為下式(II)所示的修飾核苷酸的堿基部分，通過上述修飾核苷酸的磷酸二酯鍵而被導(dǎo)入至光響應(yīng)性部分堿基序列中，(其中，式II中，Ra為氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、或氫，R2及R3各自獨(dú)立地為氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、或氫，X表示在式II中與鍵合在X上的O成為一體而形成的磷酸基，Y表示羥基，Z為氫或羥基)。(7)根據(jù)(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基作為下式(III)所示的修飾核苷酸的堿基部分，通過上述修飾核苷酸的磷酸二酯鍵而被導(dǎo)入至光響應(yīng)性部分堿基序列中，(其中，式III中，Ra表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、膦酰基、磺基、或氫原子，R2及R3各自獨(dú)立地表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、或氫原子，R4為氫原子、羥基、C1～C3的烷氧基、C1～C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6～C12的單環(huán)式或二環(huán)式的芳香族化合物的1價(jià)基團(tuán)、C6～C12的單環(huán)式或二環(huán)式的雜環(huán)系芳香族化合物的1價(jià)基團(tuán)、或下式所示的1價(jià)基團(tuán)，(其中，上述式中，Ra、R2及R3獨(dú)立于式III中記載的Ra、R2及R3，表示選自作為式III中記載的Ra、R2及R3列舉的基團(tuán)中的基團(tuán))R6表示氫原子、甲基、或乙基，Q1表示在式III中與鍵合本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種抑制光交聯(lián)的形成的方法，通過將能夠與具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基進(jìn)行光交聯(lián)的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基的、嘧啶環(huán)的5位取代成R基，來抑制具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基與能夠進(jìn)行光交聯(lián)的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基之間的光交聯(lián)的形成，其中，R為?CN、或?CO?R1，其中，R1為飽和或不飽和的、鏈狀或分支的、環(huán)式或非環(huán)式的C1～C12的烴基。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2013.10.30 JP 2013-2257991.一種抑制光交聯(lián)的形成的方法，通過將能夠與具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基進(jìn)行光交聯(lián)的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基的、嘧啶環(huán)的5位取代成R基，來抑制具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基與能夠進(jìn)行光交聯(lián)的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基之間的光交聯(lián)的形成，其中，R為-CN、或-CO-R1，其中，R1為飽和或不飽和的、鏈狀或分支的、環(huán)式或非環(huán)式的C1～C12的烴基。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，光交聯(lián)的形成是如下反應(yīng)：位于光響應(yīng)性核酸的堿基序列中的具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基、與位于部分互補(bǔ)性核酸中的該互補(bǔ)性部分堿基序列中的能夠與光響應(yīng)性堿基進(jìn)行光交聯(lián)的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基之間形成光交聯(lián)的反應(yīng)，其中，所述部分互補(bǔ)性核酸是具有與該光響應(yīng)性核酸的堿基序列中的包含光響應(yīng)性堿基的4個(gè)堿基長以上的部分堿基序列(光響應(yīng)性部分堿基序列)互補(bǔ)的部分堿基序列(互補(bǔ)性部分堿基序列)的核酸，所述方法是通過使用部分互補(bǔ)性核酸來抑制光響應(yīng)性核酸與部分互補(bǔ)性核酸之間的光交聯(lián)的形成的方法，所述部分互補(bǔ)性核酸是通過形成磷酸二酯鍵而導(dǎo)入下式(I)所示的修飾核苷酸來代替互補(bǔ)性部分堿基序列中的能夠進(jìn)行光交聯(lián)的T或U的核苷酸中的至少1個(gè)以上而形成的，其中，式I中，R為-CN、或-CO-R1，其中，R1為飽和或不飽和的、鏈狀或分支的、環(huán)式或非環(huán)式的C1～C12的烴基，X表示在式I中與鍵合在X上的O成為一體而形成的磷酸基，Y表示羥基，Z為氫或羥基。3.根據(jù)權(quán)利要求1～2中任一項(xiàng)所述的方法，其中，光響應(yīng)性核酸在同一分子中作為不同的序列區(qū)域而含有光響應(yīng)性部分堿基序列和互補(bǔ)性部分堿基序列，光響應(yīng)性核酸的分子和部分互補(bǔ)性核酸的分子是同一分子，抑制光響應(yīng)性核酸與部分互補(bǔ)性核酸之間的光交聯(lián)的形成的方法是如下方法：抑制通過光響應(yīng)性堿基與能夠進(jìn)行光交聯(lián)的胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基之間的光交聯(lián)而形成光響應(yīng)性核酸的自交聯(lián)體的方法。4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，式(I)中的R為-CN。5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基為具有3-乙烯基咔唑結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基。6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的方法，具有光交聯(lián)性的乙烯基結(jié)構(gòu)的光響應(yīng)性堿基作為下式(II)或式(III)所示的修飾核苷酸的堿基部分，通過上述修飾核苷酸的磷酸二酯鍵而被導(dǎo)入至光響應(yīng)性部分堿基序列中，其中，式II中，Ra為氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、或
\t氫，R2及R3各自獨(dú)立地為氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、或氫，X表示在式II中與鍵合在X上的O成為一體而形成的磷酸基，Y表示羥基，Z為氫或羥基；其中，式III中，Ra表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、膦酰基、磺基、或氫原子，R2及R3各自獨(dú)立地表示氰基、酰胺基、羧基、C2～C7的烷氧基羰基、或氫原子，R4表示氫原子、羥基、C1～C3的烷氧基、C1～C3的烷硫基、硝基、氟原子、氟代甲基、C6～C12的單環(huán)式或二環(huán)式的芳香族化合物的1價(jià)基...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：藤本健造，中村重孝，
申請(專利權(quán))人：國立研究開發(fā)法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)，
類型：發(fā)明
國別省市：日本;JP