一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇方法技術

本發明專利技術提供了一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇方法，首先采用CTAB法提取備選優良油菜溫敏不育系的雜交后代單株的基因組DNA，并瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的質量；然后用連鎖的SSR標記PCR擴增雜交后代單株基因組DNA，連鎖SSR標記的正反向引物序列分別為5’-CTCTCCTGATCCTCTCCTTC-3’和5’-CTTGTAGAGAACCCGAACTG-3’；PCR擴增產物用6％的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，然后依據電泳檢測結果，選擇具有目標帶的植株作為優良油菜溫敏不育系的選育材料。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分子育種領域，具體涉及一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇方法。
技術介紹
油菜溫敏不育系具有組配自由、恢復源廣、育種周期短，易選育出強優勢組合等優點，因此，作為油菜雜種優勢利用的新途徑，具有廣闊的應用前景。油菜溫敏不育系K121S屬芥菜型油菜，而目前栽培的油菜品種是甘藍型油菜，屬于不同的物種，為了利用這個油菜溫敏不育系轉育出優良的甘藍型油菜溫敏不育系，需要通過種間雜交將K121S的不育基因及育性轉換基因轉育到甘藍型油菜中，然后通過回交和人工選擇選育出優良不育系，但一般大田的人工選擇受季節限制，并費時費工，選擇效率較低。而分子標記輔助選擇具有選擇目的性強、選擇效率高、選擇時間自由等優點，已廣泛用于育種材料的人工選擇。
技術實現思路
為了解決現有技術中存在的問題，本專利技術提供了一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇方法。本專利技術的一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇方法，包括包括以下步驟：步驟①：采用CTAB法提取用于優良油菜溫敏不育系選育的雜交后代單株的基因組DNA，并檢測DNA樣品的質量；步驟②：用連鎖的SSR標記PCR擴增所述步驟①中提取的單株基因組DNA，并用4％～8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物。連鎖SSR標記的正反向引物序列分別是5’-CTCTCCTGATCCTCTCCTTC-3’和5’-CTTGTAGAGAACCCGAACTG-3’。步驟③：依據步驟②中的電泳檢測結果，將具有大小約為550bp目標帶的植株作為優良油菜溫敏不育系進一步選育的育種材料。本專利技術一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇方法，步驟②中的PCR擴增反應體系為：10×PCR緩沖液1.0～3.0μl，濃度為25mmol/L的MgCl2溶液2.0～3.0μl，濃度為2.5mmol/L的脫氧核苷酸溶液0.3～0.7μl，濃度為5U/μl的Taq酶0.7～0.9μl，濃度為10mmol/L的正反向引物各0.3～0.7μl，2～6μl的DNA，加ddH2O至10.0～30.0μl；步驟②中連鎖標記與目標基因的連鎖距離為0.8～1cm。本專利技術一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇方法，步驟②中的PCR擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，35個循環；72℃終延伸10min，4℃保存。為了使PCR擴增結果更佳，所述步驟①中提取的基因組DNA需要檢測其DNA含量及完整性，檢測方法為將基因組DNA樣品在0.8％瓊脂糖凝膠，0.5×TBE緩沖液，3-5V/cm下電泳，所述瓊脂糖凝膠中加入了核酸染料Goldview，電泳結果用凝膠成像系統照相后檢測所述基因組DNA樣品的含量及完整性，并利用核酸蛋白檢測儀檢測基因組DNA樣品的吸光度值。本專利技術相對于現有技術具有以下優點：1、本專利技術在轉育優良油菜溫敏不育系時用該SSR標記進行分子標記輔助選擇，提高了選擇目的性，將具有大小約為550bp目標帶的單株選擇出來，作為優良溫敏不育系轉育的育種材料。2、本專利技術在轉育優良油菜溫敏不育系時用該SSR標記進行分子標記輔助選擇，提高了選擇效率、減少了人力物力的投入，節約了選擇的時間。3、本專利技術在轉育優良油菜溫敏不育系時用該SSR標記進行分子標記輔助選擇，提高了選擇自由度，克服了大田人工選擇受種植季節的限制，任何時間都可以進行選擇。4、本專利技術中連鎖標記與目標基因的連鎖距離非常近，只有0.8～1cm，連鎖是非常緊密的，只要擴增出目標帶的植株就有該性狀，可作為被選株。附圖說明圖1為連鎖引物PCR擴增單株DNA的電泳結果圖。具體實施方式以下結合附圖，對本專利技術的一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇方法做進一步的詳細說明。圖1所示為連鎖引物PCR擴增單株DNA的電泳結果圖，具有目標帶(約550bp)的單株為備選單株。本專利技術的一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇方法包括以下步驟：步驟①：采用CTAB法提取用于優良油菜溫敏不育系選育的雜交后代單株的基因組DNA，并檢測DNA樣品的質量，檢測方法為將基因組DNA樣品在0.8％瓊脂糖凝膠，0.5×TBE緩沖液，3-5V/cm下電泳，瓊脂糖凝膠中加入了Goldview，電泳結果用凝膠成像系統照相后檢測基因組DNA樣品的大小及完整性，同時利用核酸蛋白檢測儀檢測基因組DNA樣品的吸光度值；步驟②：用連鎖的分子標記PCR擴增步驟①中提取的基因組DNA，PCR擴增時引物的上下游序列分別為5’-CTCTCCTGATCCTCTCCTTC-3’和5’-CTTGTAGAGAACCCGAACTG-3’，PCR擴增之后用6％的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物；步驟③：依據步驟②中的電泳檢測結果，如圖1所示，將具有大小約為550bp目標帶的植株作為優良油菜溫敏不育系進一步選育的育種材料。其中，PCR擴增反應體系為：10×PCR緩沖液2.0μl，濃度為25mmol/L的MgCl2溶液2.5μl，濃度為2.5mmol/L的脫氧核苷酸溶液0.5μl，濃度為5U/μl的Taq酶0.8μl，濃度為10mmol/L的正反向引物各0.5μl，4μl的DNA，加ddH2O至20.0μl。PCR擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，35個循環；72℃終延伸10min，4℃保存。本專利技術的一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇方法，實驗操作過程主要包括：獲取備選擇的育種材料，提取單株的基因組DNA，利用連鎖的分子標記(SSR引物)PCR擴增每個單株的DNA，凝膠電泳檢測擴增產物，將具有目標帶的單株作為選擇結果。1，基因組DNA提取(CTAB法)(1)稱取1.0g幼嫩的葉片，將葉片放到液氮預冷的研缽中，并迅速磨至粉末；(2)將研磨好的葉片粉末轉入1.5ml離心管中，并加入65℃預熱的CTAB600ul；(3)將水浴鍋調至65℃恒溫，放入裝有CTAB和樣品的離心管，每隔10-15min搖晃離心管使溶液混勻，水浴約1h；(4)從水浴鍋中取出離心管，待其冷卻后，加入等體積(約600ul)的氯仿：異戊醇＝24:1的混合液并輕輕混勻，12000rpm離心15min；(5)取離心后的上清液，并裝入一新的離心管中；(6)重復步驟(4)本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇方法，其特征在于，包括以下步驟：步驟①：采用CTAB法提取用于優良油菜溫敏不育系選育的雜交后代單株的基因組DNA，并檢測DNA樣品的質量；步驟②：用連鎖的SSR標記PCR擴增所述步驟①中提取的基因組DNA，并用4％～8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物；步驟③：依據所述步驟②中的電泳檢測結果，將具有目標帶的植株作為優良油菜溫敏不育系進一步選育的育種材料。

【技術特征摘要】
1.一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇方法，其特征在于，
包括以下步驟：
步驟①：采用CTAB法提取用于優良油菜溫敏不育系選育的雜交后代單株的
基因組DNA，并檢測DNA樣品的質量；
步驟②：用連鎖的SSR標記PCR擴增所述步驟①中提取的基因組DNA，并
用4％～8％的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物；
步驟③：依據所述步驟②中的電泳檢測結果，將具有目標帶的植株作為優良
油菜溫敏不育系進一步選育的育種材料。
2.如權利要求1所述的一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇
方法，其特征在于，所述步驟②中PCR擴增時連鎖SSR標記的正反向引物序列
分別是5’-CTCTCCTGATCCTCTCCTTC-3’和5’-CTTGTAGAGAACCCGAAC
TG-3’。
3.如權利要求2所述的一種用于轉育優良油菜溫敏不育系的分子標記輔助選擇
方法，其特征在于，所述步驟②中連鎖標記與目標基因的連鎖距離為0.8～1cm。
4.如權利要求3所述的一種用于...

【專利技術屬性】
技術研發人員：林良斌，唐天向，周筱妍，張傳利，唐偉杰，劉雅婷，
申請(專利權)人：云南農業大學，
類型：發明
國別省市：云南;53