一種鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的分子標記方法技術

本發明專利技術提供了一種鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的分子標記方法，分別以待鑒定甘蔗和“POJ2878”的基因組DNA為模板，利用引物1和引物2進行擴增，將擴增的PCR產物利用限制性核酸內切酶HaeIII進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，與抗褐銹病甘蔗品種POJ2878的酶切產物進行比較，來判斷所待鑒定甘蔗的抗病性。本發明專利技術方法可用于甘蔗抗褐銹病基因的圖位克隆和分子標記輔助選擇，通過檢測抗褐銹病基因位點來預測待鑒定甘蔗對褐銹病的抗性，不僅節約生產成本而且大大提高選擇效率，進而加速甘蔗抗褐銹病育種進程。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于甘蔗分子生物學及甘蔗抗性鑒定
更具體涉及一個與甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的分子標記鑒定方法，同時還涉及該分子標記在甘蔗抗褐銹病育種中的應用。
技術介紹
甘蔗是世界上最重要的糖料作物和重要的低碳經濟作物，蔗糖長期占世界食糖總產72%以上，其光合效率為C4作物之首，具有高光效特性、生長巨型性、可多年宿根栽培和大量固定CO2等特性，在適宜條件下畝產糖可高達1噸以上，也是迄今生物量最高的栽培作物。我國為世界第三產糖國和第二食糖消費國，蔗糖占我國食糖總產92%以上，甘蔗對保證我國食糖安全和發展低碳經濟有不可替代的作用。根據ISSCT統計，甘蔗品種改良的科技貢獻率高達60%。但是，隨著甘蔗褐銹病的爆發和流行，致使一些豐產高糖當家品種如Co475、T34362和CP78-1247被淘汰，極大地影響了蔗糖產業的持續穩定發展。由黑頂柄銹菌(PuccinamelanocephalaH.Sydow＆P.Sydow)引起的甘蔗褐銹病是一種重要的世界性甘蔗病害，嚴重危害甘蔗生長，對蔗農造成巨大的經濟損失。該病自1890年在爪哇首次被發現以來，隨后迅速擴散到世界上多數植蔗國家和地區，在古巴、牙買加、澳大利亞、美國、墨西哥、印度、泰國和毛里求斯等植蔗國家和地區普遍發生，并多次暴發流行。我國臺灣1977年首次發生甘蔗銹病，1982年首次在中國大陸云南甘蔗種植區發現該病害，之后在福建、廣東、四川、江西和廣西等蔗區先后報道。目前，該病在國內蔗區普遍發生和蔓延危害，造成甘蔗種質退化、產量降低。發病田塊一般減產15％～30％，嚴重地塊減產幅度可達40％以上，蔗糖含量降低10％～36％。尤其近年，我國蔗區主栽的一批豐產高糖品種如“桂糖15”、“桂糖17”、“桂引9號”和主推品種“粵糖60號”和“德蔗03-83”等也因高度感染銹病而面臨淘汰。甘蔗銹病的流行與品種抗病性密切相關，大面積種植感病品種是病害流行的重要原因，選育和種植抗病品種是防治該病最經濟有效的措施。而抗病種質資源的發掘利用是抗病育種的基礎和關鍵。目前，我國對甘蔗銹病抗病資源的篩選鑒定和評價還停留在人工接種表型觀察選擇，尚未開展抗銹病基因標記選擇研究。傳統的人工接種表型選擇抗病性的方法耗時、低效，鑒定結果易受病原和環境因素影響，難以滿足育種家對抗病育種要求。因此，為了保證國家的甘蔗產業可持續健康發展的進行，提高我國甘蔗生產技術水平，迫切需要建立一種簡便、快速、準確、靈敏的鑒定甘蔗抗褐銹病方法，是甘蔗抗褐銹病分子育種最關鍵的技術。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的分子標記方法，鑒定或輔助鑒定甘蔗抗褐銹病的方法及其在甘蔗抗褐銹病育種中的應用。本專利技術所提供的鑒定或輔助鑒定甘蔗抗褐銹病的方法，包括如下步驟：分別以待鑒定甘蔗和POJ2878的基因組DNA為模板，用由序列表中序列1和序列表中序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對進行PCR擴增，將擴增的PCR產物利用限制性核酸內切酶HaeIII進行酶切，通過電泳檢測擴增產物，按照如下方法確定待鑒定甘蔗對褐銹病的抗性：如果待鑒定甘蔗的PCR擴增產物電泳條帶有與POJ2878帶型相同的條帶，且大小為389bp則待鑒定甘蔗為抗褐銹病甘蔗或候選為抗褐銹病甘蔗，如果待鑒定甘蔗的PCR擴增產物電泳條帶沒有與POJ2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為非抗褐銹病甘蔗為或為候選非抗褐銹病甘蔗；所述待鑒定甘蔗為桂糖35和科5的雜交后代，上述方法中，所述待鑒定甘蔗具體選自桂糖35（抗褐銹病）和科5（感褐銹病）的雜種后代中的F1單株。在本專利技術的一個實施例中，所述待鑒定甘蔗具體選自桂糖35和科5的雜種后代中的F1單株。具體為：包括如下步驟：分別以待鑒定甘蔗和“POJ2878”的基因組DNA為模板，PCR擴增體系：2×PremixExTaqMixPCRBuffer12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μL，25ng/μL模板DNA2μL，加滅菌雙蒸水使總體積為25μL；擴增程序如下：94℃5min；94℃30S，56℃30S，72℃40S，34個循環；72℃7min。將擴增的PCR產物利用限制性核酸內切酶HaeIII進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，按照如下方法確定待鑒定甘蔗對褐銹病的抗性：如果待鑒定甘蔗的酶切產物電泳條帶有與POJ2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為抗褐銹病甘蔗，如果待鑒定甘蔗的酶切產物電泳條帶沒有與POJ2878帶型相同的條帶，則待鑒定甘蔗為非抗褐銹病甘蔗。酶切產物經過膠回收及測序，該抗性片段大小為389bp，其余條帶為非特異性擴增。所述引物1為：29-5’-TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3’；所述引物2為：417-5’-CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3’。本專利技術具有以下優點：本專利技術的引物對是與Bru1基因位點緊密連鎖的標記，是基于PCR和酶切技術產生的共顯性標記，因而可靠且使用方便，與以往的抗褐銹病標記相比，具有與目標基因Bru1緊密連鎖、準確性高、檢測效率高、成本低廉等優點。1.緊密連鎖：實驗證明，利用本方法對甘蔗育種材料輔助鑒定的結果與抗性鑒定結果完全一致，表明該方法用于甘蔗抗褐銹病育種的分子標記輔助選擇。2.準確性高:與以往的抗褐銹病標記相比，該檢測方法克服假陽性高、穩定性差等問題。3.成本低廉：本研究使用限制性內切酶HaeIII屬于廉價的四堿基內切酶，而其他方法使用是昂貴的六堿基核酸內切酶RsaI。本專利技術通過對甘蔗抗褐銹病基因的定位，開發與其緊密連鎖的分子標記方法，該方法可用于抗病基因的圖位克隆和分子標記輔助選擇，通過檢測抗褐銹病基因位點來預測甘蔗對褐銹病的抗性，可以在甘蔗的實生苗階段進行淘汰選擇，不僅節約生產成本而且大大提高選擇效率，進而加速甘蔗抗褐銹病育種進程。附圖說明圖1PCR擴增后直接進行電泳分析結果。M:Marker,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.分別代表甘蔗樣品編號為甘蔗品種POJ2878，云蔗91-510，云蔗03-194，柳城05-136，粵甘35號，崖城05-179和割手密福建89-1-1，云南合慶割手密，云南83-215，貴州78-2-04。圖2PCR產物利用RsaI酶切后進行電泳分析結果。M:Marker,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.分別代表甘蔗樣品編號為甘蔗品種POJ2878，云蔗91-510，云蔗03-194，柳城05-136，粵甘35號，崖城05-本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的引物，其特征在于：所述引物序列為引物1：29?5’?TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT?3’；引物2：417?5’??CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC?3’。

【技術特征摘要】
1.一種用于鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的引物，其特征在于：所述引物序列
為引物1：29-5’-TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3’；引物2：417-5’-
CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3’。
2.一種利用權利要求1所述的引物用于鑒定甘蔗抗褐銹病基因位點緊密連鎖的分子標
記方法，其特征在于：包括如下步驟：分別以待鑒定甘蔗和“POJ2878”的基因組DNA為模板，
PCR擴增體系：2×PremixExTaqMixPCRBuffer12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μ
L，25ng/μL模板DNA2μL，加滅菌雙蒸水使總體積為25μL；...

【專利技術屬性】
技術研發人員：郭晉隆，盧運海，許莉萍，王恒波，闕友雄，劉迪，肖乃衍，陳平華，
申請(專利權)人：福建農林大學，
類型：發明
國別省市：福建;35