進(jìn)境百合種球百合無癥病毒核酸探針雜交快速檢測方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種進(jìn)境百合種球百合無癥病毒核酸探針雜交快速檢測方法，其特征在于包括：A、百合總RNA的提取；B、RNA檢測；C、RT?PCR擴(kuò)增步驟；D、RT反轉(zhuǎn)錄；E、PCR擴(kuò)增；F、電泳分析。本發(fā)明專利技術(shù)的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種快速、簡便、高效、準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏性高，進(jìn)境百合種球百合無癥病毒核酸探針雜交快速檢測方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種進(jìn)境百合種球百合無癥病毒核酸探針雜交快速檢測方法，屬于生物

技術(shù)介紹
植物病毒既是我國進(jìn)出境植物檢疫的難點(diǎn)，也是重點(diǎn)，是植物檢疫的核心內(nèi)容，從某種意義上說，植物病毒的檢測水平體現(xiàn)了一個(gè)國家植物檢疫的整體水平。尤其在我國國門日益開放的今天，國際交往日趨頻繁，從國外引進(jìn)種子、苗木、花卉等繁殖材料也越來越多，隨之帶入的病毒的機(jī)率也就越來越大，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害性風(fēng)險(xiǎn)也就越來越高。因此，切實(shí)加強(qiáng)進(jìn)境植物病毒的檢疫，特別是對象種子、苗木、花卉等繁殖材料的檢測，將危險(xiǎn)性病毒拒之于國門之外，是從根本上保障我國農(nóng)業(yè)和國民經(jīng)濟(jì)健康和可持續(xù)發(fā)展的最有效的措施，也是我們每一個(gè)植檢人員的神圣職責(zé)。迄今為止，全世界共發(fā)現(xiàn)植物病毒909種，它們包括DNA病毒和RNA病毒二類，其中DNA病毒有141種，約占15％，而RNA病毒有768種，近占85％，而我國目前僅報(bào)道100余種。根據(jù)最新頒布的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫危險(xiǎn)性有害生物名錄》之規(guī)定，我國對外公布的危險(xiǎn)性病毒及類病毒共有39種，其中病毒類32種，類病毒7種。廣東地處我國的南方開放地區(qū),地理環(huán)境優(yōu)越,每年經(jīng)過廣東轄區(qū)口岸的進(jìn)出境種子,花卉,苗木等容易攜帶病毒的材料約占我國總數(shù)量的一半,特別是每年百合類種球進(jìn)口數(shù)量數(shù)以百萬計(jì),由于進(jìn)出境批次多,數(shù)量龐大,根本不可能每個(gè)種球都檢測得到,而且要求病毒檢測的時(shí)間短,靈敏度要高,加上專業(yè)人才又少,致使病毒的檢測工作難度巨大,一般的檢測方法難免顧此失彼,急需研究出即能保證一定的檢測數(shù)量,又能夠檢測速度快,而且靈敏度要高,成本也不太昂貴的檢測方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種快速、簡便、高效、準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏性高，進(jìn)境百合種球百合無癥病毒核酸探針雜交快速檢測方法。為了達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采用以下方案：一種進(jìn)境百合種球百合無癥病毒核酸探針雜交快速檢測方法,其特征在于包括：A、百合總RNA的提取：取1克百合樣品于研缽中，加入液氮，迅速研成均勻的粉末；將粉末全部移至冰上預(yù)冷的離心管，向離心管中加入4ml異硫氰酸胍溶液，輕輕搖晃離心管使混合均勻；按順序加入2MpH4.0的NaAc400ul，pH4.5的水飽和酚2ml、氯仿/異戊醇＝49：1的混合液2ml,輕輕搖晃均勻，最后將離心管顛倒幾次混合均勻；冰浴15min；4℃離心，13000rpm20min；將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中；然后加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻后-20℃沉淀2小時(shí)；4℃，13000rpm離心25min，小心去除上清，沉淀溶于600ul異硫氰酸胍溶液中，再加600ul異丙醇，混勻-20℃沉淀1小時(shí)；4℃，13000rpm20min；棄上清，沉淀用70％預(yù)冷的乙醇洗一遍，稍微晾干后溶于80-120ulDEPC處理過的雙蒸水中，檢測后分裝，-70℃保存；B、RNA檢測：4ulRNA+1mlddw裝入石英杯，測260nm和280nmOD值RNA的含量是:OD×10ug/ul260/280≥2則RNA純，如果<1.6則有雜質(zhì)，再用酚仿抽提，乙醇沉淀。C、RT-PCR擴(kuò)增步驟：RT-PCR檢測步驟：由于這個(gè)病毒的基因組是RNA，所以要采用RT-PCR方法進(jìn)行檢測：D、RT反轉(zhuǎn)錄：在0.5ml滅菌離心管中加入：總RNA1μgOligodT60.5μg滅菌雙蒸水至11ul混勻后置于70℃5分鐘然后在冰上冷卻后再加入：E、PCR擴(kuò)增：在0.5ml無菌薄壁離心管中加入：其中所述上游引物L(fēng)SV-P11:5’-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’下游引物L(fēng)SV-P22:5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’充分混勻后離心10sec,反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min,冷卻至延伸溫度72℃時(shí)加入2.5uTaq酶，然后按照94℃1min,退火溫度47℃或52℃1min,72℃2min,循環(huán)35次，最后72℃延伸10min，4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物，以健康植株總核酸和無菌水為陰性對照，其中LSV的退火溫度：47℃；ArMV的退火溫度：52℃反應(yīng)完畢后，取2ul反應(yīng)液在0.8％agrose膠上電泳分析。如上所述的進(jìn)境百合種球百合無癥病毒核酸探針雜交快速檢測方法,其特征在于步驟A中所述的異硫氰酸胍變性液的按以下方法配制：異硫氰酸胍2.363g1M檸檬酸鈉125μl10％十二烷基肌氨酸鈉250μl將上述組分溶于用DEPC處理過的雙蒸水中并定容至5ml,4℃保存,使用前加入2-ME35ul。如上所述的進(jìn)境百合種球百合無癥病毒核酸探針雜交快速檢測方法,其特征在于所述RT-PCR結(jié)果瓊脂糖電泳分析具體包括：用1×TAE緩沖液和瓊脂糖按1.5％的濃度配好，在微波爐中熔化均勻，冷卻至50-60℃；加入GREENI核酸染料或溴化乙錠1μg/mL,混合均勻，倒入凝膠平臺上，插上樣品梳；待凝膠凝固后，拔出梳子，加入適量的TAE緩沖液，緩沖液沒過凝膠上表面1mm；取1μL加樣緩沖液與5μLPCR反應(yīng)液混合均勻，然后分別將其和合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物加入樣品孔中；接通電源進(jìn)行電泳，電壓5V/cm；當(dāng)加樣緩沖液中的溴酚藍(lán)遷移至足夠分離DNA片段時(shí)，停止電泳，將整個(gè)膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，并照像記錄，并對產(chǎn)物進(jìn)行回收，進(jìn)行序列測定。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本專利技術(shù)做進(jìn)一步描述：實(shí)施例1一.材料1.樣品：從進(jìn)境的百合種球中截獲的含有百合無癥病毒的合種球樣品，保存于-20℃冰箱中；2.主要儀器：臺式離心機(jī)，普通電泳儀，普通PCR儀，雜交儀等；3.試劑：普通PCR使用TAKARA公司生產(chǎn)的(MasterMix)，dNTPs，RNase抑制劑,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶,，MgCl2,Taq聚合酶,pGEM-TEasy克隆載體,廣州普博生物技術(shù)公司PCR片段回收試劑盒、瓊脂糖、GREENI核酸染料、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物、異硫氰酸胍、檸檬酸鈉、十二烷基肌氨酸鈉、pGEM-T-載體、地高辛標(biāo)記試劑盒等；4.RT-PCR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)LSV保守序列設(shè)計(jì)二對特異性引物：LSV-1:5'-GAYGARYTYTTYAARATGAARGT-3'LSV-2:5'-ARYTGYTTRTGYGCRTTRTG-3'(R＝A+G；Y＝C+T)擴(kuò)增片段大小為483bp.LSV-P11:5’-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’<本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種進(jìn)境百合種球百合無癥病毒核酸探針雜交快速檢測方法,其特征在于包括：A、百合總RNA的提取：取1克百合樣品于研缽中，加入液氮，迅速研成均勻的粉末；將粉末全部移至冰上預(yù)冷的離心管，向離心管中加入4ml異硫氰酸胍溶液，輕輕搖晃離心管使混合均勻；按順序加入2M?pH4.0的NaAc?400ul，pH4.5的水飽和酚2ml、氯仿/異戊醇＝49：1的混合液2ml,輕輕搖晃均勻，最后將離心管顛倒幾次混合均勻；冰浴15min；4℃離心，13000rpm?20min；將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中；然后加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻后?20℃沉淀2小時(shí)；4℃，13000rpm離心25min，小心去除上清，沉淀溶于600ul異硫氰酸胍溶液中，再加600ul異丙醇，混勻?20℃沉淀1小時(shí)；4℃，13000rpm?20min；棄上清，沉淀用70％預(yù)冷的乙醇洗一遍，稍微晾干后溶于80?120ul?DEPC處理過的雙蒸水中，檢測后分裝，?70℃保存；B、RNA檢測：4ul?RNA+1ml?ddw裝入石英杯，測260nm和280nm?OD值RNA的含量是:OD×10ug/ul260/280≥2則RNA純，如果<1.6則有雜質(zhì)，再用酚仿抽提，乙醇沉淀。C、RT?PCR擴(kuò)增步驟：RT?PCR檢測步驟：由于這個(gè)病毒的基因組是RNA，所以要采用RT?PCR方法進(jìn)行檢測：D、RT反轉(zhuǎn)錄：在0.5ml滅菌離心管中加入：總RNA??????????????1μgOligo?dT?6?????????0.5μg滅菌雙蒸水至???????11ul混勻后置于70℃5分鐘然后在冰上冷卻后再加入：37℃?孵育5分鐘加入40uM??MuLV37℃孵育60分鐘，70℃10分鐘終止反應(yīng)并置于4℃?zhèn)溆茫籈、PCR擴(kuò)增：在0.5ml?無菌薄壁離心管中加入：其中所述上游引物L(fēng)SV?P11:5’?AAGATGAAAGTTGGCGTCGT?3’下游引物L(fēng)SV?P22:5’?CACAAGCATGCTGTTCCACA?3’充分混勻后離心10sec,反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min,冷卻至延伸溫度72℃時(shí)加入2.5u?Taq酶，然后按照94℃1min,退火溫度47℃或52℃1min,72℃2min,循環(huán)35次，最后72℃延伸10min，4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物，以健康植株總核酸和無菌水為陰性對照，其中LSV的退火溫度：47℃；ArMV的退火溫度：52℃反應(yīng)完畢后，取2ul反應(yīng)液在0.8％agrose膠上電泳分析。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種進(jìn)境百合種球百合無癥病毒核酸探針雜交快速檢測方法,其特征在于包括：
A、百合總RNA的提取：
取1克百合樣品于研缽中，加入液氮，迅速研成均勻的粉末；
將粉末全部移至冰上預(yù)冷的離心管，向離心管中加入4ml異硫氰酸胍溶液，輕輕搖晃離
心管使混合均勻；
按順序加入2MpH4.0的NaAc400ul，pH4.5的水飽和酚2ml、氯仿/異戊醇＝49：1的混合
液2ml,輕輕搖晃均勻，最后將離心管顛倒幾次混合均勻；冰浴15min；4℃離心，13000rpm
20min；將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中；然后加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻后-20℃沉淀2小
時(shí)；4℃，13000rpm離心25min，小心去除上清，沉淀溶于600ul異硫氰酸胍溶液中，再加600ul
異丙醇，混勻-20℃沉淀1小時(shí)；4℃，13000rpm20min；棄上清，沉淀用70％預(yù)冷的乙醇洗一
遍，稍微晾干后溶于80-120ulDEPC處理過的雙蒸水中，檢測后分裝，-70℃保存；
B、RNA檢測：
4ulRNA+1mlddw裝入石英杯，測260nm和280nmOD值
RNA的含量是:OD×10ug/ul
260/280≥2則RNA純，如果<1.6則有雜質(zhì)，再用酚仿抽提，乙醇沉淀。
C、RT-PCR擴(kuò)增步驟：
RT-PCR檢測步驟：由于這個(gè)病毒的基因組是RNA，所以要采用RT-PCR方法進(jìn)行檢測：
D、RT反轉(zhuǎn)錄：
在0.5ml滅菌離心管中加入：
總RNA1μg
OligodT60.5μg
滅菌雙蒸水至11ul
混勻后置于70℃5分鐘然后在冰上冷卻后再加入：
37℃孵育5分鐘
加入40uM--MuLV
37℃孵育60分鐘，70℃10分鐘終止反應(yīng)并置于4℃?zhèn)溆茫?br>E、PCR擴(kuò)增：
在0.5ml無菌薄壁離心管中加入：

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳定虎，楊雷亮，管維，楊志方，吳穎兒，
申請(專利權(quán))人：中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44