一種多肽及其作為細(xì)菌或哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體的應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種多肽及其作為細(xì)菌或哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體的應(yīng)用。所涉及的多肽的結(jié)構(gòu)如式(1)所示。本發(fā)明專利技術(shù)的轉(zhuǎn)染體系，能夠轉(zhuǎn)染多種類型小核酸分子，分枝狀肽與小核酸分子以非共價方式結(jié)合形成納米粒，納米粒制備簡單；本發(fā)明專利技術(shù)的多肽不僅適用于細(xì)菌的轉(zhuǎn)染，同時也適用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。i＝3,6或10；XP3為-R-K-R,YP3為-R-W-L-A-W-L；XP6為-R-R-K-R,YP6為-W-L-A-W-L-Ac；XP10為-R-R-H-R,YP3為-W-L-A-W-L-Ac。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥
，具體涉及一種多肽及其作為細(xì)菌或哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
近些年來，小核酸分子藥物得到越來越多的關(guān)注與研究。不僅在哺乳細(xì)胞上得到了廣泛的研究與應(yīng)用，也成為抗菌藥物研究新的突破點。小核酸分子是通過堿基互補配對原理，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)基因組學(xué)相關(guān)信息，以細(xì)胞內(nèi)增殖、致病等相關(guān)基因為靶點，干擾基因的解旋、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、mRNA的剪接加工至輸出和翻譯等各個環(huán)節(jié)，從阻斷相關(guān)基因表達(dá)入手，進(jìn)而達(dá)到治療作用。然而，一個未經(jīng)修飾的由10個單體組成的寡核苷酸分子量一般在2-3kDa，各種化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾將進(jìn)一步增加其大小，核酸分子量增大，細(xì)胞攝入率降低，從而不能更好地進(jìn)入細(xì)胞而發(fā)揮治療作用。此外，在細(xì)菌中，由于細(xì)菌的細(xì)胞壁具有不同尋常的結(jié)構(gòu)，這種有效的屏障會使外來分子難以透過，包括小分子化合物和小核酸分子，特別是脂多糖組成的革蘭陰性菌的外膜也是阻礙分子進(jìn)入細(xì)菌的一個主要障礙。多種反義基因靶向核酸藥物遞藥系統(tǒng)已成功地應(yīng)用于真核細(xì)胞的基因治療，然而由于細(xì)菌細(xì)胞和真核細(xì)胞尺寸、結(jié)構(gòu)組成不同，這些適用于真核細(xì)胞的基因遞藥系統(tǒng)并不完全合適。研究表明，除了脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)之外，透膜肽(CPPs)也可用于抗菌反義寡核苷酸分子的運載工具，但相關(guān)研究卻很少，目前僅發(fā)現(xiàn)HIV-TAT，pVEC和(RXR)4三種透膜肽通過與反義寡核苷酸共價結(jié)合，可實現(xiàn)反義抗菌分子的遞送。但這種共價結(jié)合導(dǎo)致合成成本較高，載藥量低及工業(yè)化生產(chǎn)困難等問題，極大地限制了小核酸藥物抗菌的發(fā)展。
技術(shù)實現(xiàn)思路
針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，本專利技術(shù)的目的之一是提供一種多肽。該多肽的結(jié)構(gòu)為：i＝3,6或10；XP3為-R-K-R,YP3為-R-W-L-A-W-L；XP6為-R-R-K-R,YP6為-W-L-A-W-L-Ac；XP10為-R-R-H-R,YP3為-W-L-A-W-L-Ac。本專利技術(shù)同時提供了多肽-核酸分子復(fù)合物的制備方法：方法包括多肽與脂質(zhì)混合后加入核酸分子制備多肽-核酸分子復(fù)合物；所述脂質(zhì)為DOTAP、DOPC、DODAG、DOPE、DMTAP、DPPC、RPR209120、Chol、Cardiolipin、DODMA、DSPC、DGG、DLinDMA、DLin-KC2-DMA、PEG2000-C-DMA、AtuFECT01、DphyPE、DSGLA或DSPE。進(jìn)一步，本專利技術(shù)的制備方法中鹽離子濃度小于0.2mM。進(jìn)一步，本專利技術(shù)的制備方法中多肽與核酸中N與P的摩爾比為8：1，脂質(zhì)的質(zhì)量與核酸質(zhì)量相等。本專利技術(shù)的核酸分子為asRNA、siRNA、miRNA或質(zhì)粒DNA。本專利技術(shù)還提供了上述多肽作為細(xì)菌轉(zhuǎn)染載體的應(yīng)用。本專利技術(shù)同時還提供了上述多肽作為哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的優(yōu)點在于：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染具有毒性；慢病毒轉(zhuǎn)染有免疫原性；共價結(jié)合方式的多肽轉(zhuǎn)染合成成本高，而且轉(zhuǎn)染對象單一。本專利技術(shù)的轉(zhuǎn)染體系，能夠轉(zhuǎn)染多種類型小核酸分子，分枝狀肽與小核酸分子以非共價方式結(jié)合形成納米粒，納米粒制備簡單；不僅適用于細(xì)菌的轉(zhuǎn)染，同時也適用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。附圖說明圖1為P3的質(zhì)譜譜圖；圖2為P3的高效液相圖譜；圖3為P6的質(zhì)譜譜圖；圖4為P6的高效液相色譜譜圖；圖5為P10的質(zhì)譜譜圖；圖6為P10的高效液相色譜譜圖；圖7為Pep3/PS-ODN/DOTAP納米復(fù)合物的電鏡照片；圖8為Pep6/PS-ODN/DOTAP納米復(fù)合物的電鏡照片；圖9為Pep10/PS-ODN/DOTAP納米復(fù)合物的電鏡照片；圖10為Pep3、Pep6、Pep10包裹PS-ODN的包封率；圖11為Pep3/PS-ODN/DOTAP、Pep6/PS-ODN/DOTAP、Pep10/PS-ODN/DOTAP納米復(fù)合物4℃保存4周的粒徑穩(wěn)定性；圖12為Pep3/PS-ODN/DOTAP納米復(fù)合物的細(xì)菌攝取檢測結(jié)果，其中A為PS-ODN對照組；B為實驗組，結(jié)果顯示Pep3/PS-ODN/DOTAP納米復(fù)合物可被細(xì)菌高效攝取；圖13為Pep6/PS-ODN/DOTAP納米復(fù)合物的細(xì)菌攝取檢測結(jié)果，其中A為PS-ODN對照組；B為實驗組，結(jié)果顯示Pep6/PS-ODN/DOTAP納米復(fù)合物可被細(xì)菌高效攝取；圖14為Pep10/PS-ODN/DOTAP納米復(fù)合物的細(xì)菌攝取實驗結(jié)果，其中A為PS-ODN對照組；B為實驗組，結(jié)果顯示Pep10/PS-ODN/DOTAP納米復(fù)合物可被細(xì)菌高效攝取；圖15為anti-rpoDPep3/PS-ODN/DOTAP納米復(fù)合物(濃度0.5μM)對ESBLs-E.coli生長的抑制實驗結(jié)果；圖16為anti-rpoDPep10/PS-ODN/DOTAP納米復(fù)合物(濃度0.5μM)對ESBLs-E.coli生長的抑制實驗結(jié)果；圖17為Pep10/PS-ODN/DOTAP納米復(fù)合物抑制細(xì)菌靶基因mecAmRNA的水平實驗結(jié)果；圖18為Pep10/siRNA/DOTAP納米復(fù)合物抑制哺乳細(xì)胞靶基因GAPDHmRNA的水平實驗結(jié)果。具體實施方式一、本專利技術(shù)多肽的結(jié)構(gòu)表1本專利技術(shù)多肽的結(jié)構(gòu)二、本專利技術(shù)多肽的合成方法及表征P3、P6和P10同屬于兩親性肽，以P6的合成方法為例(合成方法采用Fmoc固相合成法)。1、合成原料及相關(guān)試劑：保護(hù)氨基酸原料：Fmoc-L-Leu-OH，F(xiàn)moc-L-Trp(BOC)-OH，F(xiàn)moc-L-Ala-OH，F(xiàn)moc-L-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-L-Lys(BOC)-OH，F(xiàn)moc-L-Lys(BOC)-OH，F(xiàn)moc-L-Lys(DDE)-OH,Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH等(成都誠諾)；縮合試劑：HBTU(昊帆生物科技)，DIEA(國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)；溶劑：DMF(Dikma)，DCM(Dikma)，甲醇(Fisher)，乙腈(Fisher)；樹脂：取代度為0.28mmol/g的RinkAmide-MBHAResin(天津市南開合成科技有限公司)；脫保護(hù)試劑：哌啶(國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)；檢測試劑：苯酚試劑(自配)，吡啶試劑(自配)，茚三酮試劑(自配)；切割試劑：TFA(J.T.Baker)，TIS(ALDRICH)，EDT，無水乙醚(上海試一化學(xué)試劑有限公司)；精密電子天平(北京賽多利斯天平有限本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
一種多肽，該多肽的結(jié)構(gòu)為：i＝3,6或10；XP3為?R?K?R,YP3為?R?W?L?A?W?L；XP6為?R?R?K?R,YP6為?W?L?A?W?L?Ac；XP10為?R?R?H?R,YP3為?W?L?A?W?L?Ac。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種多肽，該多肽的結(jié)構(gòu)為：
i＝3,6或10；
XP3為-R-K-R,YP3為-R-W-L-A-W-L；
XP6為-R-R-K-R,YP6為-W-L-A-W-L-Ac；
XP10為-R-R-H-R,YP3為-W-L-A-W-L-Ac。
2.多肽-核酸分子復(fù)合物的制備方法，其特征在在于，方法包括多肽與脂
質(zhì)混合后加入核酸分子制備多肽-核酸分子復(fù)合物，所述多肽為權(quán)利要求1所
述多肽的一種；所述脂質(zhì)為DOTAP、DOPC、DODAG、DOPE、DMTAP、DPPC、
RPR209120、Chol、Cardiolipin、DODMA、DSPC、DG...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：薛小燕，陳周，羅曉星，胡玥，周穎，侯征，李明凱，孟靜茹，
申請(專利權(quán))人：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：陜西;61