HIV-1早期感染相關的血清miRNA在制備試劑盒中的應用制造技術

本發明專利技術屬于生物技術領域，具體涉及一種基于血清miRNA的試劑盒及其使用方法在HIV-1感染早期檢測中的應用。本發明專利技術涉及的miRNA分子包括hsa-miR-29a、hsa-miR-223、hsa-miR-27a、hsa-miR-19b、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-766、hsa-miR-30a-5p和hsa-miR-136*。用這9種血清miRNA作為分子靶標，建立了一種快速、敏感、特異的HIV-1感染早期的檢測方法。本發明專利技術涉及上述9種miRNA在病毒感染早期診斷中的用法及檢測這9種miRNA所用的試劑盒。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，具體涉及一種基于血清miRNA的試劑盒及其使用方法及其人類免疫缺陷(HIV-1)病毒早期感染檢測中的應用。
技術介紹
隨著人們生活水平的不斷提高，由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起艾滋病(AIDS)由原來的吸毒、暗娼等高危人群開始向一般人群擴散，疫情不僅嚴重地威脅我國人民健康，而且影響到經濟發展和社會穩定。截止2011年底，我國存活艾滋病感染者和艾滋病人78萬，每年新發HIV感染者4.8萬人。早期發現和早期診斷艾滋病患者是減少傳播機會、控制疫情的關鍵環節。目前的實驗室檢測包括HIV抗體、病毒載量、CD4+T淋巴細胞、P24抗原檢測等。HIV抗體檢測陽性雖然是HIV感染的金標準，但是一般抗體在感染病毒后4周才逐漸出現，患者從感染HIV到血清HIV抗體陽性反應的窗口期由于病毒的大量復制，具有較強的傳染性；應用RT-PCR技術檢測窗口期血液中的病毒核酸雖然具有很高的靈敏度，但是HIV病毒具有高度的變異性，隨著抗病毒治療的推廣，病毒變異和耐藥株不斷出現，使檢測的敏感性受到了限制；P24抗原檢測能夠在窗口期檢測到抗原，但易出現假陽性；CD4淋巴細胞水平隨著感染的發展而逐漸下降，一般用于病程監測。因此，尋找新的診斷技術，既要簡便快速又要敏感、特異，是縮短窗口期，實現早期診斷，治療、預測和監測疾病進程的迫切任務。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是約22個核苷酸長、單鏈、內源的非編碼RNA，在轉錄后或翻譯水平調節相關基因表達。最近研究表明血清miRNA不僅在腫瘤、心血管、代謝性等疾病，而且在病毒感染性疾病如肝炎的早期診斷中起著非常重要的作用，血清中成熟的miRNA分子具有高度的穩定性，而且在病毒血癥消失后依然可以檢測到。因此建立一種基于血清miRNA作為HIV感染的診斷標志物用于疾病的早期診斷及病程的監測具有重要意義。
技術實現思路
本專利技術的第一目的是提供一種能夠用于檢測HIV-1病毒早期感染的新的血清miRNA標志物及其在制備制備HIV-1感染早期檢測試劑盒中的應用。本專利技術的第二目的是提供一種HIV-1感染早期檢測試劑盒及其使用方法。為了實現上述目的，本專利技術采用的技術方案如下：本專利技術提供了一種HIV-1早期感染相關的血清miRNA標志物，所述的miRNA標志物為包括如下9種：hsa-miR-29a(UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA)，其序列信息如SEDIDNO.1所示，hsa-miR-223(UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA)，其序列信息如SEDIDNO.2所示，hsa-miR-27a(UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC)，其序列信息如SEDIDNO.3所示，hsa-miR-19b(UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA)，其序列信息如SEDIDNO.4所示，hsa-miR-151-3p(CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG)，其序列信息如SEDIDNO.5所，hsa-miR-28-5p(AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG)，其序列信息如SEDIDNO.6所示，hsa-miR-766(ACUCCAGCCCCACAGCCUCAGC)，其序列信息如SEDIDNO.7所示，hsa-miR-30a-5p(UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG)，其序列信息如SEDIDNO.8所示，hsa-miR-136*(CAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU)，其序列信息如SEDIDNO.9所示。上述9種血清miRNA標志物篩選方法分為以下步驟：(一)低密度芯片用于檢測患者血清miRNA的表達譜初步篩選，低密度芯片v3.0(TaqManLow-densityArray,TLDA)(AppliedBiosystems,CA)包含A和B兩種陣列，共能檢測754種人的miRNA。每塊array都包含3種內參和一種陰參。ArrayA上主要檢測的是比較被關注的miRNA，ArrayB上主要是近期被發現的miRNA。具體方法如下：(1)核酸提取：收集HIV-1感染早期病人血清10份，每份以30μL混合，健康正常人血清10份，每份以30μL混合，將兩組血清(每組300ul)用試劑盒NucleoSpinmiRNAPlasmakit(Macherey-NagelGmbh&Co.KG,Germany)提取血清中的miRNA；(2)逆轉錄反應：提取的血清miRNA反轉錄采用TaqmanmiRNAReverseTranscriptionKit及RT引物均為ABI(AppliedBiosystems,CA，USA)公司提供；(3)預擴增反應：為了提高TLDA檢測的靈敏性，逆轉錄后的cDNA需要加一步預擴增，其中預擴增引物MegaplexPreAmpprimer和試劑盒TaqManPreAmpMasterMix,2x由ABI(AppliedBiosystems,CA,USA)公司提供。(4)PCR反應：預擴增產物稀釋后用于TLDA的PCR擴增，所用的試劑TaqManUniversalMasterMix,NoAmpEraseUNG和TLDA由ABI(AppliedBiosystems,CA,USA)公司提供。(5)數據分析：數據分析使用SDSRelativeQuantificationSoftwareversion2.3(AppliedBiosystems)。CT值(Thresholdcycle)大于等于40的為40(未檢測出)。(二)根據以上表達譜結果進行分析，初步選出與正常人血清表達譜比較有顯著差異的血清miRNA做為候選基因做進一步驗證，在這里我們設定三個標準：(1)Ct值<35的檢測值是認為比較可靠的；(2)患者血清miRNA與正常人血清miRNA相比的比值變化達到3倍以上；(3)與疾病相關的有生物學意義的候選miRNA。具體方法如下：(1)核酸提?。候炞C的miRNA提取每份樣品用200μl血清，同時每份待測血清中加入25fmol的cel-miR-238做為內參，提取試劑盒和方法同上(低密度芯片部分miRNA提取)。(2)逆轉錄及PCR反應：qRT-PCR所用的RTstem-loop引物，TaqManmiRNA逆轉錄試劑盒(ReverseTranscriptionKit)，PCR引物和探針，TaqManUniversalPCRMasterMix(NoAmpEraseUNG)均由ABI(AppliedBiosystems,CA,USA)公司提供。(3)統計分析：對于熒光定量qRT-PCR所得到的Ct值用cel-miR-238的Ct值做本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種HIV?1早期感染相關的血清miRNA標志物，其特征在于，所述的miRNA標志物包括如下9種：hsa?miR?29a，其序列信息如SED?ID?NO.1所示，hsa?miR?223，其序列信息如SED?ID?NO.2所示，hsa?miR?27a，其序列信息如SED?ID?NO.3所示，hsa?miR?19b，其序列信息如SED?ID?NO.4所示，hsa?miR?151?3p，其序列信息如SED?ID?NO.5所示，hsa?miR?28?5p，其序列信息如SED?ID?NO.6所示，hsa?miR?766，其序列信息如SED?ID?NO.7所示，hsa?miR?30a?5p，其序列信息如SED?ID?NO.8所示，hsa?miR?136*，其序列信息如SED?ID?NO.9所示。

【技術特征摘要】
1.一種HIV-1早期感染相關的血清miRNA標志物，其特征在于，所述的miRNA標志物包括
如下9種：
hsa-miR-29a，其序列信息如SEDIDNO.1所示，
hsa-miR-223，其序列信息如SEDIDNO.2所示，
hsa-miR-27a，其序列信息如SEDIDNO.3所示，
hsa-miR-19b，其序列信息如SEDIDNO.4所示，
hsa-miR-151-3p，其序列信息如SEDIDNO.5所示，
hsa-miR-28-5p，其序列信息如SEDIDNO.6所示，
hsa-miR-766，其序列信息如SEDIDNO.7所示，
hsa-miR-30a-5p，其序列信息如SEDIDNO.8所示，
hsa-miR-136*，其序列信息如SEDIDNO.9所示。
2.權利要求1所述的血清miRNA標志物在制備HIV-1感染早期檢測試劑盒中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的試劑盒包括以下組分：(1)RNA提取
試劑，以及cel-miR-238內參；(2)血清miRNA標志物的檢測試劑，包括AMV反轉錄體系及反轉
錄引物、PCR反應體系及引物；(3)陰性對照，滅菌去離子水。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：所述cel-miR-238內參，是人工合成的外源
性的線蟲的miRNA,其序列信息如SEDIDNO.10所示。
5.一種HIV-1感染早期檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括權利要求1所述血
清miRNA標志物的檢測試劑；所述的檢測試劑包括AMV逆轉錄體系及反轉錄引物、PCR反應體
系及引物、陰性對照，滅菌去離子水。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括RNA提取試劑，以及
cel-miR-238內參是人工合成的外源性的線蟲的miRNA,其序列信息如SEDIDNO.10所示。
7...

【專利技術屬性】
技術研發人員：戚宇華，胡海洋，郭宏雄，崔侖標，還錫萍，周明浩，
申請(專利權)人：江蘇省疾病預防控制中心，
類型：發明
國別省市：江蘇;32