本發(fā)明專利技術(shù)屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種CYP3A5基因的檢測引物組及其構(gòu)成的反應(yīng)體系，所述檢測引物組如下：正向外側(cè)引物F3A：SEQ?ID?NO:1；反向外側(cè)引物B3A：SEQ?ID?NO:2；正向內(nèi)側(cè)引物FIPA：SEQ?ID?NO:3；反向內(nèi)側(cè)引物BIPA：SEQ?ID?NO:4；正向外側(cè)引物F3G：SEQ?ID?NO:5；反向外側(cè)引物B3G：SEQ?ID?NO:6；正向內(nèi)側(cè)引物FIPG：SEQ?ID?NO:7；反向內(nèi)側(cè)引物BIPG：SEQ?ID?NO:8。本發(fā)明專利技術(shù)步驟簡單、擴增反應(yīng)快速、高效、特異性高、鑒定簡便，使該技術(shù)有著更廣闊的應(yīng)用前景。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物檢測
，具體涉及一種CYP3A5基因的檢測引物組、其構(gòu)成的反應(yīng)體系及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
細胞色素P450(cytochromeP450或CYP450)簡稱CYP450，主要存在于肝臟、腸道中的單加氧酶，是人體內(nèi)參與內(nèi)源性物質(zhì)和外源性化合物代謝過程的一組超家族酶類，尤其在藥物的體內(nèi)代謝過程中扮演重要角色。其中，CYP3A5參與他克莫司、咪達唑侖、氨苯砜、可的松、尼菲地平等多種藥物的代謝。該基因的一個SNP，rs776746(CYP3A5*3，6986A>G)，會導(dǎo)致CYP3A5基因的mRNA過短地剪切，形成一個“不完整的”CYP3A5蛋白，從而導(dǎo)致CYP3A5酶蛋白活性的降低甚至消失。據(jù)統(tǒng)計，CYP3A5*3等位基因在中國人群中出現(xiàn)的頻率約為75％，而攜帶突變型等位基因的患者在臨床藥物治療過程中的表現(xiàn)與野生型攜帶者大相徑庭。例如，在臨床器官移植術(shù)后使用的主要免疫抑制劑類藥物他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K506)，其代謝過程主要由CYP3A5進行調(diào)控。如果CYP3A5基因出現(xiàn)突變，則會導(dǎo)致病人體內(nèi)他克莫司的血藥濃度大幅度增高，并出現(xiàn)腎毒性、神經(jīng)毒性、高血壓和胃腸道紊亂等一系列藥物毒副作用。因此，在臨床中檢測CYP3A5基因分型對于臨床治療，特別是器官移植術(shù)后病人的臨床用藥治療實現(xiàn)個體化安全用藥具有重要的指導(dǎo)作用。目前，關(guān)于CYP3A5基因分型的檢測多采用熒光定量PCR，基因測序以及基因芯片等技術(shù)手段。CN104498592A公開了一種人CYP3A5基因檢測方法，包括提供待測樣品、核酸擴增體系和熒光檢測體系混合物；通過擴增反應(yīng)循環(huán)擴增靶多核苷酸；使熒光發(fā)生基團與被擴增的靶多核苷酸序列間接結(jié)合；測定熒光量；所述核酸擴增體系至少分別包含CYP3A5基因CYP3A5*1和CYP3A5*3多態(tài)性的特異性正向引物和反向引物。使用這些方法進行CYP3A5基因分型檢測均不同程度存在購買儀器成本高，操作程序復(fù)雜，檢測周期較長等問題，不利于提高檢測效率并實現(xiàn)臨床推廣普及。然而，從目前來看，這種檢測需求又非常巨大，因此，尋找一種高效且價格容易被患者接受的檢測手段，對于CYP3A5基因分型檢測有著重要的現(xiàn)實意義。環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(LAMP)技術(shù)是日本科學家于2000年提出的一種等溫擴增技術(shù)，其主要特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下進行恒溫擴增，僅需15-90分鐘即可產(chǎn)生109-1010數(shù)量級的產(chǎn)物。具有敏感性高、特異性好、操作簡便、成本低廉且結(jié)果易于判定的優(yōu)點。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)為了克服上述方法的缺陷，提供一種CYP3A5基因的檢測引物組、其構(gòu)成的反應(yīng)體系及應(yīng)用，所述檢測體系具有敏感性高、特異性好和操作簡便等優(yōu)點。為達到此專利技術(shù)的目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：第一方面，本專利技術(shù)提供一種CYP3A5基因的檢測引物組，所述檢測引物組如下：正向外側(cè)引物F3A：SEQIDNO:1：ATTATGGAGAGTGGCATAGG；反向外側(cè)引物B3A：SEQIDNO:2：TTAGGGTGTGACACACAG；正向內(nèi)側(cè)引物FIPA：SEQIDNO:3：TTTAAAGACAAAAGAGCTCTTTAAAGAGAAGATACCCACGTATGTACCA；反向內(nèi)側(cè)引物BIPA：SEQIDNO:4：TGGTCATGGGTAATATGCTTCGTGGTAAGAAAGCCCCAATGGTACT；正向外側(cè)引物F3G：SEQIDNO:5：GAGTGGCATAGGAGATACC；反向外側(cè)引物B3G：SEQIDNO:6：TTAGGGTGTGACACACAG；正向內(nèi)側(cè)引物FIPG：SEQIDNO:7：CTTAAAGACAAAAGAGCTCTTTAAAGAACGTATGTACCACCCAGC；反向內(nèi)側(cè)引物BIPG：SEQIDNO:8：CCTGTTTGGACCACATTACCCCAAGAGTCTCACACAGGAG。優(yōu)選地，所述SEQIDNO:1-4所示的序列是用于檢測rs776746位點的A等位基因。優(yōu)選地，所述SEQIDNO:5-8所示的序列是用于檢測rs776746位點的G等位基因。本專利技術(shù)中，4條引物的外側(cè)引物記為正向外側(cè)引物F3和反向外側(cè)引物B3，內(nèi)側(cè)引物記為正向內(nèi)側(cè)引物FIP和反向內(nèi)側(cè)引物BIP，其中FIP包含了F1c和F2，BIP包含了B1c和B2，上述引物均由在線軟件PrimerExplorerV4設(shè)計。本專利技術(shù)在普通LAMP的基礎(chǔ)上，以特異性要求最嚴格的F1c的5’端針對rs776746位點設(shè)計等位基因特異引物，分別檢測rs776746的A等位基因和rs776746的G等位基因。通過分別在FIPA和FIPG的5’端第三位引進額外突變，進一步降低非特異性擴增的可能性。第二方面，本專利技術(shù)提供一種檢測CYP3A5基因的反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系包括第一方面所述的引物組，反應(yīng)緩沖液，dNTPs，羥基萘酚藍，甜菜堿，BstDNA聚合酶，待檢樣品基因組DNA和去離子水。優(yōu)選地，所述反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCl，KCl，(NH4)2SO4，MgSO4和Tween-20。優(yōu)選地，所述Tris-HCl的濃度為10-30mM，例如可以是10mM、11mM、12mM、13mM、15mM、16mM、18mM、20mM、22mM、23mM、25mM、26mM、28mM或30mM，優(yōu)選為15-25mM，進一步優(yōu)選為20mM。優(yōu)選地，所述KCl的濃度為10-60mM，例如可以是10mM、11mM、12mM、15mM、18mM、20mM、23mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM或60mM，優(yōu)選為50-55mM，進一步優(yōu)選為50mM。優(yōu)選地，所述(NH4)2SO4的濃度為5-13mM，例如可以是5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM或13mM，優(yōu)選為8-12mM，進一步優(yōu)選為10mM。優(yōu)選地，所述MgSO4的濃度為2-8mM，例如可以是2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM或8mM，優(yōu)選為2-6mM，進一步優(yōu)選為4mM。優(yōu)選地，所述Tween-20的體積分數(shù)為0.1-1％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％，優(yōu)選為0.1％。優(yōu)選地，所述dNTPs的濃度為1-2mM，例如可以是1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種CYP3A5基因的檢測引物組，其特征在于，所述檢測引物組如下：正向外側(cè)引物F3A：SEQ?ID?NO:1；反向外側(cè)引物B3A：SEQ?ID?NO:2；正向內(nèi)側(cè)引物FIPA：SEQ?ID?NO:3；反向內(nèi)側(cè)引物BIPA：SEQ?ID?NO:4；正向外側(cè)引物F3G：SEQ?ID?NO:5；反向外側(cè)引物B3G：SEQ?ID?NO:6；正向內(nèi)側(cè)引物FIPG：SEQ?ID?NO:7；反向內(nèi)側(cè)引物BIPG：SEQ?ID?NO:8。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種CYP3A5基因的檢測引物組，其特征在于，所述檢測引物組如下：
正向外側(cè)引物F3A：SEQIDNO:1；
反向外側(cè)引物B3A：SEQIDNO:2；
正向內(nèi)側(cè)引物FIPA：SEQIDNO:3；
反向內(nèi)側(cè)引物BIPA：SEQIDNO:4；
正向外側(cè)引物F3G：SEQIDNO:5；
反向外側(cè)引物B3G：SEQIDNO:6；
正向內(nèi)側(cè)引物FIPG：SEQIDNO:7；
反向內(nèi)側(cè)引物BIPG：SEQIDNO:8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測引物組，其特征在于，所述SEQIDNO:1-4所示的序列是
用于檢測rs776746位點的A等位基因；
優(yōu)選地，所述SEQIDNO:5-8所示的序列是用于檢測rs776746位點的G等位基因。
3.一種檢測CYP3A5基因的反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系包括權(quán)利要求1或2所
述的引物組，反應(yīng)緩沖液，dNTPs，羥基萘酚藍，甜菜堿，BstDNA聚合酶，待檢樣品基因組DNA
和去離子水。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)緩沖液包括Tris-HCl，KCl，
(NH4)2SO4，MgSO4和Tween-20；
優(yōu)選地，所述Tris-HCl的濃度為10-30mM，優(yōu)選為15-25mM，進一步優(yōu)選為20mM；
優(yōu)選地，所述KCl的濃度為10-60mM，優(yōu)選為50-55mM，進一步優(yōu)選為50mM；
優(yōu)選地，所述(NH4)2SO4的濃度為5-13mM，優(yōu)選為8-12mM，進一步優(yōu)選為10mM；
優(yōu)選地，所述MgSO4的濃度為2-8mM，優(yōu)選為2-6mM，進一步優(yōu)選為4mM；
優(yōu)選地，所述Tween-20的體積分數(shù)為0.1-1％，優(yōu)選為0.1％。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的反應(yīng)體系，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張井存，汪大為，
申請(專利權(quán))人：北京晉祺生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11
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