CYP4F2基因的檢測引物組、其構成的反應體系及應用制造技術

本發明專利技術屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種CYP4F2基因的檢測引物組及其構成的反應體系，所述檢測引物組如下：正向外側引物F3：SEQ?ID?NO:1；反向外側引物B3：SEQ?ID?NO:2；正向內側引物FIP：SEQ?ID?NO:3；反向內側引物BIPC：SEQ?ID?NO:4；反向內側引物BIPT：SEQ?ID?NO:5。本發明專利技術步驟簡單、擴增反應快速、高效、特異性高、鑒定簡便，使該技術有著更廣闊的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物檢測
，具體涉及一種CYP4F2基因的檢測引物組、其構成的反應體系及應用。
技術介紹
華法林，是一種香豆素類抗凝劑，作為臨床應用最為廣泛的抗凝藥物之一，具有價格低廉，小劑量即可起效等優點，主要用于防治靜動脈血栓栓塞性疾病,適用患者人群為心臟瓣膜置換、房顫、深靜脈血栓和肺栓塞患者。但是，目前在臨床上，華法林的用藥面臨一個嚴重的問題，即華法林的給藥劑量非常難以掌握,劑量不足會導致體內血栓的產生，而劑量稍大則會加大出血的傾向。目前，國內外臨床工作者們多采用定期監測國際標準化比值(INR)和凝血酶原時間(PT)兩種手段監測華法林的臨床藥效。而近年來，對于華法林藥效學影響因素的研究熱點則主要集中在遺傳藥物基因組學方面這個研究領域。由于華法林的抗凝作用主要由S-華法林產生，而S-華法林的體內代謝主要是由細胞色素P450酶超家族中的CYP2C9完成CYP2C9可以催化人體內的華法林成為無活性形式6-或7-羥基華法林，所以CYP2C9的活性對華法林的抗凝治療效果有著十分重要的影響。除此之外，另外一種等位基因CYP4F2的遺傳多態性與華法林劑量也有不可忽視的關聯。CYP4F2*3(rs2108622C>T，V433M)可導致細胞色素藥物酶活性降低，相反患者體內維生素K的濃度會增高。所以攜帶這種突變型等位基因的患者在使用華法林時，體內出血風險與野生型等位基因攜帶者相比會大大增高。因此，臨床上在使用華法林進行治療的過程中，對于CYP4F2*3突變型等位基因的檢測，會給華法林的安全使用帶來更可靠的保障。目前，臨床及市場上針對CYP4F2的突變型等位基因檢測已經有了商品化的試劑盒，這些試劑盒所采用的技術主要包括Taqman-MGB熒光探針法、液相芯片法、一代測序法、二代測序法。CN104561302A公開了一種CYP4F2基因多態性的檢測探針，所述檢測探針的核苷酸序列選自序列1和序列2，5’和3’端分別具有熒光基團和淬滅基團，并且熒光基團所發熒光的波長峰值在不同的位置。這些技術手段均在不同方面展現出了自己的優勢，但是也都普遍存在檢測儀器及配套試劑耗材購買成本高昂，檢測需要復雜的變溫循環過程，周期長、操作繁瑣且假陽性率時有出現的問題。因此，專利技術并構建一套價格低廉，使用操作簡便且利于臨床檢驗大范圍普及的商品化試劑盒就顯得十分重要。環介導的等溫擴增(LAMP)技術是日本科學家于2000年提出的一種等溫擴增技術，其主要特點是針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下進行恒溫擴增，僅需15-90分鐘即可產生109-1010數量級的產物。具有敏感性高、特異性好、操作簡便、成本低廉且結果易于判定的優點。
技術實現思路
本專利技術為了克服上述方法的缺陷，提供一種CYP4F2基因的檢測引物組、其構成的反應體系及應用，所述檢測體系具有敏感性高、特異性好和操作簡便等優點。為達到此專利技術的目的，本專利技術采用以下技術方案：第一方面，本專利技術提供一種CYP4F2基因的檢測引物組，所述檢測引物組如下：正向外側引物F3：SEQIDNO:1：GAGAGACAGACAGTTGTGTGT；反向外側引物B3：SEQIDNO:2：CCCTCAGTGAAGGAGGCC；正向內側引物FIP：SEQIDNO:3：GCTCCTAGAGGAGGGGGCAGGTCTTTGAGGGAGGTGATGTTG；反向內側引物BIPC：SEQIDNO:4：CATCTGGGTTGTGATGGGTTCCCCTTCTCTCCCACAGGCAT；反向內側引物BIPT：SEQIDNO:5：TATCTGGGTTGTGATGGGTTCCCCTTCTCTCCCACAGGCAT。優選地，所述SEQIDNO:1-4所示的序列是用于檢測rs2108622位點的C等位基因。優選地，所述SEQIDNO:1-3和SEQIDNO:5所示的序列是用于檢測rs2108622位點的T等位基因。本專利技術中，外側引物記為正向外側引物F3和反向外側引物B3，內側引物記為正向內側引物FIP和反向內側引物BIP，其中FIP包含了F1c和F2，BIP包含了B1c和B2，上述引物均由在線軟件PrimerExplorerV4設計。本專利技術在普通LAMP的基礎上，以特異性要求最嚴格的B1c的5’端針對rs2108622位點設計等位基因特異引物，分別檢測rs2108622的C等位基因和rs2108622的T等位基因。通過分別在BIPC和BIPT的5’端第三位引進額外突變，進一步降低非特異性擴增的可能性。第二方面，本專利技術提供一種檢測CYP4F2基因的反應體系，所述反應體系包括第一方面所述的引物組，反應緩沖液，dNTPs，羥基萘酚藍，甜菜堿，BstDNA聚合酶，待檢樣品基因組DNA和去離子水。優選地，所述反應緩沖液包括Tris-HCl，KCl，(NH4)2SO4，MgSO4和Tween-20。優選地，所述Tris-HCl的濃度為10-30mM，例如可以是10mM、11mM、12mM、13mM、15mM、16mM、18mM、20mM、22mM、23mM、25mM、26mM、28mM或30mM，優選為15-25mM，進一步優選為20mM。優選地，所述KCl的濃度為10-60mM，例如可以是10mM、11mM、12mM、15mM、18mM、20mM、23mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM或60mM，優選為50-55mM，進一步優選為50mM。優選地，所述(NH4)2SO4的濃度為5-13mM，例如可以是5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM或13mM，優選為8-12mM，進一步優選為10mM。優選地，所述MgSO4的濃度為2-8mM，例如可以是2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM或8mM，優選為2-6mM，進一步優選為4mM。優選地，所述Tween-20的體積分數為0.1-1％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％，優選為0.1％。優選地，所述dNTPs的濃度為1-2mM，例如可以是1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM或2mM，優選為1.2-1.8mM，進一步優選為1.4mM。優選地，所述羥基萘酚藍的濃度為108-130μM，例如可以是108μM、本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種CYP4F2基因的檢測引物組，其特征在于，所述檢測引物組如下：正向外側引物F3：SEQ?ID?NO:1；反向外側引物B3：SEQ?ID?NO:2；正向內側引物FIP：SEQ?ID?NO:3；反向內側引物BIPC：SEQ?ID?NO:4；反向內側引物BIPT：SEQ?ID?NO:5。

【技術特征摘要】
1.一種CYP4F2基因的檢測引物組，其特征在于，所述檢測引物組如下：
正向外側引物F3：SEQIDNO:1；
反向外側引物B3：SEQIDNO:2；
正向內側引物FIP：SEQIDNO:3；
反向內側引物BIPC：SEQIDNO:4；
反向內側引物BIPT：SEQIDNO:5。
2.根據權利要求1所述的檢測引物組，其特征在于，所述SEQIDNO:1-4所示的序列是
用于檢測rs2108622位點的C等位基因；
優選地，所述SEQIDNO:1-3和SEQIDNO:5所示的序列是用于檢測rs2108622位點的T
等位基因。
3.一種檢測CYP4F2基因的反應體系，其特征在于，所述反應體系包括權利要求1或2所
述的引物組，反應緩沖液，dNTPs，羥基萘酚藍，甜菜堿，BstDNA聚合酶，待檢樣品基因組DNA
和去離子水。
4.根據權利要求3所述的反應體系，其特征在于，所述反應緩沖液包括Tris-HCl，KCl，
(NH4)2SO4，MgSO4和Tween-20；
優選地，所述Tris-HCl的濃度為10-30mM，優選為15-25mM，進一步優選為20mM；
優選地，所述KCl的濃度為10-60mM，優選為50-55mM，進一步優選為50mM；
優選地，所述(NH4)2SO4的濃度為5-13mM，優選為8-12mM，進一步優選為10mM；
優選地，所述MgSO4的濃度為2-8mM，優選為2-6mM，進一步優選為4mM；
優選地，所述Tween-20的體積分數為0.1-1％，優選為0.1％。
5.根據權利要求3或4所述的反應體系，其特征在于，所述dNTPs的濃度為1-2mM，優選為
...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張井存，汪大為，
申請(專利權)人：北京晉祺生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：北京;11