用于測定DNA的組織或細胞來源的方法和試劑盒技術

公開了檢測受試者的細胞類型或組織的死亡的方法。所述方法包括測定受試者的流體樣品中包含的無細胞DNA是否來源于所述細胞類型或組織，其中所述測定通過確定無細胞DNA的連續序列上至少4個甲基化位點的甲基化狀態來實現，所述序列包含不超過300個核苷酸，其中所述細胞類型或組織特有的DNA的連續序列上所述至少4個甲基化位點的每一個的甲基化狀態指示所述細胞類型或組織的死亡。還公開了用于檢測細胞死亡的試劑盒。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】專利
和背景本專利技術，在其一些實施方案中，涉及測定無細胞DNA的來源的方法和其用于診斷與細胞死亡有關的病理過程、監測意圖改變細胞死亡的治療方案例如藥物的用途，和其為臨床和科研目的而研究影響細胞死亡水平的過程的用途。數十年來已知血漿包含源自死亡細胞的無細胞循環DNA(cfDNA)的小片段(平均5000個基因組當量/ml)。盡管釋放和清除cfDNA的基礎機制仍不清楚，但該現象迅速用于與臨床有關的各種應用。胎兒DNA的片段短暫在母體循環中移動的公認打開了基于下一代測序(NGS)的產前檢驗以鑒定胎兒三體性和其它遺傳畸變的道路，有可能代替羊膜穿刺術。在癌癥生物學中，已知腫瘤釋放DNA(包括腫瘤-特異性體細胞突變)至循環，提供了用于液體活檢以監測腫瘤動力學和基因組進化的手段。此外，根據區分供體與受體的DNA的單核苷酸多態性(SNPs)，cfDNA已用于檢測在腎、肝或心臟移植后的移植物細胞死亡。在所有這些情況中，在目的組織(胎兒、腫瘤或移植物)和宿主的DNA序列之間存在遺傳差異，這提供了高度特異性測定法的基礎。已知在多種另外的條件例如創傷性腦損傷、心血管疾病、膿毒癥和強烈運動時，cfDNA的血液水平增加。然而在這些情況下，升高的cfDNA的來源是未知的，極大地損害了cfDNA作為診斷或預后工具的功用。例如，cfDNA可能來源于受損傷組織的實質細胞，但也可能來源于臨死的炎性細胞。盡管具有相同的核苷酸序列，但體內各細胞類型的DNA帶有與其基因表達譜相關的獨特的表觀遺傳標記。具體而言，用來抑制非轉錄的基因的DNA甲基化，是組織身份的基本方面。對各細胞類型而言，甲基化模式是獨特的，在相同個體和個體之間的相同類型的細胞中保守，并且在生理或病理條件下高度穩定。因此，使用cfDNA的DNA甲基化模式來測定其來源組織并因此推斷來源器官中的細胞死亡是可能的。在理論上，考慮到cfDNA的總量、源自目的組織的分數和估計的cfDNA半壽期(15-120分鐘)，這樣的方法可鑒定目的組織中的細胞死亡比率。注意，因為該方法依賴于細胞身份的正常的穩定標記，其不能鑒定病理的性質(例如，區分源自死亡腫瘤細胞或由于在相同組織中創傷或炎癥導致的死亡野生型細胞的cfDNA)。組織特異性細胞死亡的高度敏感性、最小侵入測定的潛在用途包括早期準確診斷以及在臨床和藥物開發背景中監測對療法的反應。組織-特異性DNA甲基化的經典實例由胰島素基因啟動子提供，其在產生胰島素的胰腺β-細胞中未甲基化和在別處甲基化。最近的研究在新診斷的T1D患者的循環中以及在胰島移植物受體中鑒定了未甲基化胰島素啟動子DNA，可能反映了β–細胞的自身免疫和同種免疫破壞兩者(AkiravE.M.等ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,108,19018-19023(2011);LebastchiJ等,Diabetes62,1676-1680(2013);HusseinyM.I.Plosone9e94591(2014;和HeroldK.C.等,JClinInvest.Doi:10.1172/jc178142(2015))。其它
技術介紹
包括國際PCT公開號WO2013131083、WO2014138133和WO201101728。專利技術概述根據本專利技術的一些實施方案的一個方面，提供檢測受試者的細胞類型或組織的死亡的方法，包括測定受試者的流體樣品中包含的無細胞DNA是否來源于所述細胞類型或組織，其中所述測定通過確定無細胞DNA的連續序列上至少4個甲基化位點的甲基化狀態來實現，所述序列包含不超過300個核苷酸，其中所述細胞類型或組織特有的DNA的連續序列上至少4個甲基化位點的每一個的甲基化狀態指示細胞類型或組織的死亡。根據本專利技術的一些實施方案的一個方面，提供鑒定目的細胞類型或組織的甲基化標記的方法，包括在目的細胞類型的DNA中鑒定包含至少4個甲基化位點的不超過300個核苷酸的連續序列，其中相對于第二種不同的細胞類型或組織，所述位點的每一個被差異甲基化，從而鑒定目的細胞類型或組織的甲基化標記。根據本專利技術的一些實施方案的一個方面，提供測定樣品中的DNA是否來源于目的細胞類型或組織的方法，所述方法包括：確定DNA的連續序列上至少4個甲基化位點的甲基化狀態，所述序列包含不超過300個核苷酸，其中目的細胞特有的連續序列的至少4個甲基化位點的每一個的甲基化狀態指示DNA來源于目的細胞。根據本專利技術的一些實施方案的一個方面，提供用于鑒定樣品中的DNA來源的試劑盒，其包含能夠檢測核酸序列中至少4個甲基化位點的甲基化狀態的寡核苷酸，所述核酸序列不超過300個堿基對和包含相對于與第一種目的細胞不同的第二種細胞，在第一種目的細胞中差異甲基化的至少4個甲基化位點。根據本專利技術的一些實施方案的一個方面，提供用于鑒定樣品中的DNA來源的試劑盒，其包含能夠擴增具有不超過300個堿基對的核酸序列的DNA的至少兩種寡核苷酸，其中所述核酸序列包含相對于與第一種目的細胞不同的第二種細胞，在第一種目的細胞中差異甲基化的至少4個甲基化位點。根據本專利技術的一些實施方案，所述甲基化狀態是非病變目的細胞類型或組織特有的。根據本專利技術的一些實施方案，所述序列包含50-250個核苷酸。根據本專利技術的一些實施方案，當所述細胞類型的死亡與病理過程有關時，所述方法還包括診斷所述病理過程。根據本專利技術的一些實施方案，所述DNA是無細胞DNA。根據本專利技術的一些實施方案，所述DNA是細胞DNA。根據本專利技術的一些實施方案，所述方法還包括在測定之前裂解細胞DNA的細胞。根據本專利技術的一些實施方案，至少4個甲基化位點包含至少5個甲基化位點。根據本專利技術的一些實施方案，目的細胞類型包含在體液內。根據本專利技術的一些實施方案，樣品包含體液。根據本專利技術的一些實施方案，所述體液選自血液、血漿、精液、乳、尿、唾液和腦脊液。根據本專利技術的一些實施方案，所述確定使用至少一種甲基化-依賴性寡核苷酸實現。根據本專利技術的一些實施方案，所述甲基化-依賴性寡核苷酸與4個甲基化位點的至少1個雜交，所述位點是甲基化的。根據本專利技術的一些實施方案，所述甲基化-依賴性寡核苷酸與4個甲基化位點的至少1個雜交，所述位點是未甲基化的。根據本專利技術的一些實施方案，所述確定使用甲基化-非依賴性寡核苷酸實現。根據本專利技術的一些實施方案，所述確定使用至少兩種甲基化-非依賴性寡核苷酸實現。根據本專利技術的一些實施方案，所述確定通過以下實現：(a)使樣品中的DNA與亞硫酸氫鹽接觸，以轉化DNA的去甲基化胞嘧啶為尿嘧啶；(b)使用與鄰近DNA的連續序列上的至少4個甲基化位點的第一個和最后一個的核酸序列雜交的寡核苷酸，擴增DNA的連續序列；和(c)對DNA的連續序列測序。根據本專利技術的一些實施方案，樣品包含來源于與所述細胞類型或組織不同的第二種細胞的無細胞DNA。根據本專利技術的一些實施方案，所述方法還包括分析源自所述細胞類型或組織的無細胞DNA的量:源自第二種細胞的無細胞DNA的量。根據本專利技術的一些實施方案，所述方法還包括分析源自所述細胞類型或組織的無細胞DNA的量:樣品中無細胞DNA的總量。根據本專利技術的一些實施方案，所述細胞類型選自胰腺β細胞、胰腺本文檔來自技高網...

【技術保護點】
檢測受試者的細胞類型或組織的死亡的方法，包括測定受試者的流體樣品中包含的無細胞DNA是否來源于所述細胞類型或組織，其中所述測定通過確定無細胞DNA的連續序列上至少4個甲基化位點的甲基化狀態來實現，所述序列包含不超過300個核苷酸，其中所述細胞類型或組織特有的DNA的所述連續序列上的所述至少4個甲基化位點的每一個的甲基化狀態指示細胞類型或組織的死亡。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.04.14 US 61/9792331.檢測受試者的細胞類型或組織的死亡的方法，包括測定受試者的流體樣品中包含的無細胞DNA是否來源于所述細胞類型或組織，其中所述測定通過確定無細胞DNA的連續序列上至少4個甲基化位點的甲基化狀態來實現，所述序列包含不超過300個核苷酸，其中所述細胞類型或組織特有的DNA的所述連續序列上的所述至少4個甲基化位點的每一個的甲基化狀態指示細胞類型或組織的死亡。2.鑒定目的細胞類型或組織的甲基化標記的方法，包括在目的細胞類型的DNA中鑒定包含至少4個甲基化位點的不超過300個核苷酸的連續序列，其中相對于第二種不相同的細胞類型或組織，所述位點的每一個被差異甲基化，從而鑒定所述目的細胞類型或組織的甲基化標記。3.測定樣品中的DNA是否來源于目的細胞類型或組織的方法，所述方法包括：確定所述DNA的連續序列上至少4個甲基化位點的甲基化狀態，所述序列包含不超過300個核苷酸，其中所述目的細胞特有的所述連續序列上所述至少4個甲基化位點的每一個的甲基化狀態指示所述DNA來源于所述目的細胞。4.權利要求1或3的方法，其中所述甲基化狀態是非病變目的細胞類型或組織特有的。5.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述序列包含50-250個核苷酸。6.權利要求1的方法，其中當所述細胞類型的死亡與病理過程有關時，所述方法還包括診斷所述病理過程。7.權利要求2或3的方法，其中所述DNA是無細胞DNA。8.權利要求2或3的方法，其中所述DNA是細胞DNA。9.權利要求8的方法，其中所述方法還包括在所述測定之前裂解所述細胞DNA的細胞。10.權利要求1-9中任一項的方法，其中所述至少4個甲基化位點包含至少5個甲基化位點。11.權利要求2的方法，其中所述目的細胞類型包含在體液中。12.權利要求3的方法，其中所述樣品包含體液。13.權利要求1、11或12的方法，其中所述體液選擇血液、血漿、精液、乳、尿、唾液和腦脊液。14.權利要求1或3-13中任一項的方法，其中所述確定使用至少一種甲基化-依賴性寡核苷酸實現。15.權利要求14的方法，其中所述甲基化-依賴性寡核苷酸與所述4個甲基化位點的至少1個雜交，所述位點是甲基化的。16.權利要求14的方法，其中所述甲基化-依賴性寡核苷酸與所述4個甲基化位點的至少1個雜交，所述位點是未甲基化的。17.權利要求1或3-13中任一項的方法，其中所述確定使用甲基化-非依賴性寡核苷酸實現。18.權利要求1或3-13中任一項的方法，其中所述確定使用至少兩種甲基化-非依賴性寡核苷酸實現。19.權利要求1、3-13、17或18中任一項的方法，其中所述確定通過以下實現：(a)使樣品中的DNA與亞硫酸氫鹽接觸，以將DNA的去甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶；(b)使用與在DNA的所述連續序列上鄰近所述至少4個甲基化位點的第一個和最后一個的核酸序列雜交的寡核苷酸，擴增DNA的所述連續序列；和(...

【專利技術屬性】
技術研發人員：Y多爾，R舍梅，B格拉賽，
申請(專利權)人：耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發展公司，哈達錫特醫學研究服務及發展有限公司，
類型：發明
國別省市：以色列;IL