雙末端聚乙二醇化整合素?結合肽及其使用方法技術

本發明專利技術提供了靶向整合素(例如αvβ6整合素)的雙末端PEG化肽偶聯物。在具體實施方案中，本發明專利技術的肽偶聯物還包含生物試劑，例如成像劑或治療劑，例如它們共價連接至PEG部分之一。本發明專利技術的肽偶聯物可特別用于成像腫瘤、器官或組織，并用于治療整合素?介導的疾病和病癥，例如癌癥、炎性疾病、自身免疫疾病、慢性纖維化、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺氣腫和慢性創傷性皮膚病。包含本發明專利技術的肽偶聯物的組合物和試劑盒有廣泛的應用，包括例如體內成像和免疫治療。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】相關申請的交叉引用本申請要求于2014年4月15日提交的美國臨時申請No.61/979,997的優先權，其內容通過引用整體納入本文用于本文所有目的。關于聯邦資助的研究和開發下所作專利技術的權利的聲明本專利技術是在由能源部授予的第DE-SC0002061號基金的政府支持下進行的。政府對本專利技術享有一定權利。
技術介紹
整合素是一個負責介導細胞-細胞和細胞-細胞外基質(ECM)粘附的細胞表面受體的大家族。存在至少24種不同的整合素，每種都是由α和β亞基組成的異二聚體，其表達由包括組織類型、發育階段和各種組織病理學(例如炎癥和癌癥)的數種因素決定。雖然它們不具有任何內在酶活性，但是在與配體結合后，整合素通過使細胞質結構和信號分子的復合物并置，然后這些分子相互作用并決定細胞反應，從而將細胞外的線索轉化為細胞內信號。由于整合素參與細胞行為的大多數方面，其中包括運動性、增殖、侵襲和存活，因此它們在疾病中的作用已被廣泛報道。事實上，一些整合素被認為在促進某些疾病(包括癌癥)中起到了積極的作用。例如，αvβ3整合素涉及促進黑色素瘤和成膠質細胞瘤的侵襲性表型，這是由于其所具有的多種能力，其中包括上調原侵襲性金屬蛋白酶以及提供原遷移性存活信號。由于αvβ3在血管生成的血管的內皮細胞上也被上調，并且可以為癌中新血管的發展提供類似的信號，因此這樣的數據已經導致許多藥物和學術中心開發用于治療目的的αvβ3的拮抗劑，其中許多已經是肽或肽模擬物。因此，理解整合素-配體相互作用的結構基礎，將有助于設計改進的整合素拮抗劑。αvβ6整合素受體僅在上皮細胞上表達。該整合素涉及正常和病理組織過程。例如，αvβ6在傷口愈合和炎癥期間被上皮細胞上調。很可能αvβ6通過與其保護性原肽(即潛伏相關肽(LAP))結合從而局部激活TGF-β的能力，解釋了這種整合素在這些瞬時病理中的功能。因此，TGF-β可以抑制炎癥反應和上皮增殖，這表明αvβ6作為抑制這些過程的陰性對照。然而，慢性炎癥可導致過量的TGF-β被αvβ6-依賴性地活化，從而導致實驗動物的肺中的纖維化。因此，導致人纖維化的一些病理學也可能涉及αvβ6-依賴性的TGF-β活化。小鼠皮膚中組成型αvβ6過表達，導致在大量轉基因動物上出現慢性傷口。因此，與人類疾病(例如，某些形式的表皮松解大皰)相關的慢性傷口，也可以通過由傷口的角質形成細胞表達的αvβ6的上調來促進或加重。最近，已經清楚αvβ6整合素是癌癥中的主要新靶。雖然αvβ6是上皮特異性的，在大多數靜息的上皮組織中它是弱的或不可檢測的，但在許多類型的癌癥中強烈上調，通常位于侵入前沿。例如，αvβ6在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)、胰腺癌、卵巢癌和結腸癌中高度上調。已經表明，αvβ6可以通過上調金屬蛋白酶和促進增加的運動性來促進癌侵襲，從而使得通過Akt的上調來促進癌細胞的存活。這些數據表明，αvβ6積極促進侵入性表型。還已經顯示，αvβ6的高表達與結腸癌患者的中值存活率的顯著下降是相關的。此外，αvβ6整合素已經在體外通過與病毒衣殼蛋白VP1中RGD基序結合而被鑒定為口蹄疫病毒(FMDV)的受體。結構研究已經揭示，FMDV與細胞結合的模式之一是通過其蛋白質-殼上的含有31個氨基酸的小環。該FMDV環高選擇性和特異性地結合于αvβ6。PCT公開號WO07/039728描述了放射性標記的αvβ6靶向肽A20FMDV2，其由FMDV環的20個核心氨基酸組成，其在競爭性ELISA結合測定中以高特異性和選擇性結合固定的人αvβ6。在無胸腺nu/nu小鼠模型中，用PET評估了放射性標記的A20FMDV2對表達αvβ6的人腫瘤進行成像的能力。然而，這些體內研究顯示，放射性標記的αvβ6靶向肽發生了快速代謝。事實上，1小時后，尿中的放射性大致相等地分布在三種代謝物之間并且未檢測到未代謝的肽。也觀察到來自αvβ6表達腫瘤的放射性被清除。特別地，在注射后1、2和4小時，每克腫瘤的肽注射劑量的百分比(％ID/g)分別為0.66、0.28和0.06。鑒于上述，本領域需要腫瘤靶向劑，其不僅對表達αvβ6的腫瘤具有高腫瘤選擇性和特異性，而且能夠在αvβ6表達的腫瘤中具有增加的代謝穩定性和滯留性。本專利技術滿足這種需要并具有相關的優點。
技術實現思路
本專利技術提供了靶向整合素(例如αvβ6整合素)的雙末端PEG化肽偶聯物。在具體實施方案中，本專利技術的肽偶聯物還包含生物試劑，例如成像劑或治療劑，例如共價連接至PEG部分之一。本專利技術的肽偶聯物特別適用于成像腫瘤、器官或組織以及用于治療整合素介導的疾病和病癥，例如癌癥、炎性疾病、自身免疫疾病、慢性纖維化、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺氣腫和慢性創傷性皮膚病。包含本專利技術的肽偶聯物的組合物和試劑盒，可用于廣泛的應用，包括例如體內成像和免疫治療。一方面，本專利技術提供了一種偶聯物，其包含：(a)結合整合素的肽；(b)共價連接到所述肽的氨基末端的第一聚乙二醇(PEG)部分；和(c)共價連接到所述肽的羧基末端的第二聚乙二醇(PEG)部分。在一些實施方案中，所述肽包含選自下組的氨基酸序列：RGD、LDV和GFOGER，其中，O是羥脯氨酸。在其他實施方案中，所述整合素是αvβ3整合素，αIIbβ3整合素或αvβ6整合素。在優選的實施方案中，所述整合素是αvβ6整合素。在某些實施方案中，αvβ6整合素-結合肽包含氨基酸序列RGDLX1X2X3，其中X1和X2是獨立選擇的氨基酸，X3是L或I。在某些實施方案中，X1是Q，X2是V，X3是L。在具體實施方案中，所述肽包含氨基酸序列RGDLX1X2X3AQX6，其中X6是K或R。在某些實施例中，X6是R。在其它實施方案中，所述αvβ6整合素-結合肽包含氨基酸序列RSDLTPLFX7，其中X7不存在或者是任意氨基酸。在某些實施例中，X7不存在(即，所述肽包含氨基酸序列RSDLTPLF)。在某些其他實施例中，X7是K(即，所述肽包含氨基酸序列RSDLTPLFK)。在優選的實施方案中，所述肽包含選自下組的氨基酸序列或由選自下組的氨基酸序列組成：NAVPNLRGDLQVLAQKVART(A20FMDV2)和NAVPNLRGDLQVLAQRVART(A20FMDV2K16R)。在可替換的實施方案中，所述肽是結合于靶目標整合素(例如αvβ6整合素)的肽模擬物。在其它實施方案中，所述肽結合于整合素以及與整合素共表達的受體。在某些實施例中，所述與整合素共表達的受體是C-X-C趨化因子受體4型(CXCR4)。在另外的實施方案中，所述肽的長度為約8至約45個氨基酸。在某些實施例中，所述肽的長度為20個氨基酸。在一些實施方案中，所述第一PEG部分和所述第二PEG部分各自具有小于約5000道爾頓(Da)，例如小于約3000Da的分子量。在優選的實施方案中，所述第一PEG部分和所述第二PEG部分是具有確定鏈長的單分散PEG部分。具有確定鏈長的PEG部分的非限制性實例包括：具有大于約95％寡聚體純度的小的單分散PEG分子。在某些實施例下，所述第一PEG部分和所述第二PEG部分各自獨立地選自下組：PEG11，PEG12(PEG800)，PEG28(PEG1500)和(PEG28)2(PEG1500x2)。在具體實施方案中，所述第一PEG部分和本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種偶聯物，其包含：(a)結合整合素的肽；(b)共價連接到所述肽的氨基末端的第一聚乙二醇(PEG)部分；和(c)共價連接到所述肽的羧基末端的第二PEG部分。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2014.04.15 US 61/979,9971.一種偶聯物，其包含：(a)結合整合素的肽；(b)共價連接到所述肽的氨基末端的第一聚乙二醇(PEG)部分；和(c)共價連接到所述肽的羧基末端的第二PEG部分。2.如權利要求1所述的偶聯物，其中所述肽包含選自下組的氨基酸序列：RGD、LDV和GFOGER，其中，O是羥脯氨酸。3.如權利要求1或2所述的偶聯物，其中所述整合素是αvβ3整合素、αIIbβ3整合素或αvβ6整合素。4.如權利要求3所述的偶聯物，其中所述整合素是αvβ6整合素。5.如權利要求4所述的偶聯物，其中所述肽包含氨基酸序列RGDLX1X2X3，其中X1和X2是獨立選擇的氨基酸，且X3是L或I。6.如權利要求5所述的偶聯物，其中X1是Q，X2是V，且X3是L。7.如權利要求5或6所述的偶聯物，其中所述肽包含氨基酸序列RGDLX1X2X3AQX6，其中X6是K或R。8.如權利要求7所述的偶聯物，其中X6是R。9.如權利要求4所述的偶聯物，其中所述肽包含選自下組的的氨基酸序列：NAVPNLRGDLQVLAQKVART(A20FMDV2)和NAVPNLRGDLQVLAQRVART(A20FMDV2K16R)。10.如權利要求1至9中任一項所述的偶聯物，其中所述肽結合所述整合素以及與整合素共表達的受體。11.如權利要求10所述的偶聯物，其中與整合素共表達的受體是CXCR4。12.如權利要求1至11中任一項所述的偶聯物，其中所述偶聯物還包含與所述肽、所述第一PEG部分或所述第二PEG部分共價連接的成像劑或治療劑。13.如權利要求1至12中任一項所述的偶聯物，其中所述肽的長度為約8至約45個氨基酸。14.如權利要求1至13中任一項所述的偶聯物，其中所述第一PEG部分和所述第二PEG部分各自具有小于約3000道爾頓(Da)的分子量。15.如權利要求14的偶聯物，其中所述第一PEG部分和所述第二PEG部分各自獨立地選自下組：PEG12(PEG800)，PEG28(PEG1500)和(PEG28)2(PEG1500x2)。16.如權利要求1至15中任一項所述的偶聯物，其中所述第一PEG部分和所述第二PEG部分是相同的。17.如權利要求16所述的偶聯物，其中所述第一PEG部分和所述第二PEG部分都是PEG28(PEG1500)。18.如權利要求1至17中任一項所述的偶聯物，其中所述第一PEG部分和所述第二PEG部分是具有確定鏈長的單分散PEG部分。19.如權利要求18的組合物，其中所述單分散PEG部分具有大于約95％的低聚物純度。20.如權利要求12至19中任一項所述的偶聯物，其中所述成像劑選自下組：放射性核素、生物素、熒光團、熒光蛋白、抗體、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、及其組合。21.如權利要求20所述的偶聯物，其中所述放射性核素選自下組：11C、13N、15O、18F、19F、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、68Ga、111In、124I、125I和131I。22.如權利要求20或21所述的偶聯物，其中所述放射性核素通過輔基連接到所述肽、所述第一PEG部分或所述第二PEG部分。23.如權利要求12至19中任一項所述的偶聯物，其中所述治療劑選自下組：放射性核素、促凋亡肽、納米顆粒、化療劑、納米滴、脂質體藥物、細胞因子、及其組合。24.如權利要求23所述的偶聯物，其中所述放射性核素選自下組：90Y和177Lu。25.如權利要求23或24所述的偶聯物，其中所述放射性核素通過螯合劑連接到所述肽、所述第一PEG部分或所述第二PEG部分。26.如權利要求23所述的偶聯物，其中所述促凋亡肽包含D(KLAKLAK)2。27.如權利要求23或26所述的...

【專利技術屬性】
技術研發人員：S·H·豪斯納，J·L·薩克利夫，
申請(專利權)人：加利福尼亞大學董事會，
類型：發明
國別省市：美國;US