乙草胺的免疫膠體金檢測卡及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)乙草胺的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，涉及動(dòng)物源食品獸藥殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)的檢測卡外殼中的試紙條，由PVC膠板、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成；膠體金膜為含乙草胺單克隆抗體的玻璃纖維素膜，包被膜是硝酸纖維素膜，其上設(shè)有T線和C線，T線包被有乙草胺蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，C線包被有羊抗鼠IgG抗體。本發(fā)明專利技術(shù)有效用于快速檢測乙草胺，方便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及谷物食品中農(nóng)藥殘留檢測
，特別是涉及乙草胺的免疫膠體金檢測卡及其制備方法。
技術(shù)介紹
乙草胺是廣譜、保護(hù)性殺菌劑。作用機(jī)理是能與真菌細(xì)胞中的三磷酸甘油醛脫氫酶發(fā)生作用，與該酶中含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而破壞該酶活性，使真菌細(xì)胞的新陳代謝受破壞而失去生命力。乙草胺沒有內(nèi)吸傳導(dǎo)作用，但噴到植物體上之后，能在體表上有良好的黏著性，不易被雨水沖刷掉，因此藥效期較長。因此定期對乙草胺殘留進(jìn)行檢測成為許多國家的監(jiān)控的必要手段。現(xiàn)有技術(shù)對于乙草胺的檢測主要是氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜法等檢測方法，但這些技術(shù)的缺陷明顯：設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、難以推廣。所以，建立一種簡單、有效、適合基層使用的測定方法是極其必要的。本專利技術(shù)的目的是研制一種更適合企業(yè)進(jìn)行現(xiàn)場檢測且快捷簡便、成本低廉的定性檢測方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對以上情況，本專利技術(shù)的目的就是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種乙草胺的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，可有效解決能快速、簡便地檢測出乙草胺的問題。本專利技術(shù)的乙草胺膠體金檢測卡，包括包被了單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金結(jié)合墊、包被了乙草胺-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC膠板和塑料模具組成，在PVC膠板的一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。本專利技術(shù)的乙草胺膠體金檢測卡的制備方法，是由以下步驟實(shí)現(xiàn)：(1)膠體金溶液制備：取1L三角燒瓶1個(gè)，加入超純水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時(shí)，維持5min后停止加熱，補(bǔ)水至原體積，冷卻至室溫，2-8℃保存?zhèn)溆茫?2)抗體的預(yù)處理：將要標(biāo)記的乙草胺抗體在1000r/min,4℃條件下，離心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/ml，過0.22μm濾膜；(3)膠體金標(biāo)記物的制備：取步驟(1)中的膠體金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8.5，電磁攪拌器250r/min攪拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應(yīng)10min；逐滴加入4mL10%BSA，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10min；金標(biāo)抗體溶液常溫低速（1500r/min）離心10min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4℃，12000r/min離心20min，棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至1mL，制備成乙草胺單克隆抗體膠體金標(biāo)記物；(4)膠體金膜的制備：將步驟(3)乙草胺蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用劃膜儀以5μL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37℃烘干3h，制成含乙草胺蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜；(5)包被膜制備：將羊抗鼠IgG抗體、乙草胺蛋白質(zhì)偶聯(lián)物稀釋成1mg/mL，用劃膜儀依次以1μL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37℃包被2h后，室溫自然晾干或者37℃烘干；(6)樣品墊前處理：將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；(7)檢測卡的組裝：PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。所述步驟(5)中所包被的檢測線T設(shè)在質(zhì)控線C的下方；所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由1g小牛血清蛋白(BSA)和0.8g氯化鈉(NaCl)，用含有0.5%TRITON-100的0.01mol/LPBS定容至100mL；本專利技術(shù)可有效用于測定乙草胺，方法簡單，方便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確。附圖說明圖1為本專利技術(shù)乙草胺的免疫膠體金檢測卡的結(jié)構(gòu)圖：圖中1.加樣孔2.檢測線3.質(zhì)控線4.檢測孔5.試紙條6.檢測卡外殼。圖2為本專利技術(shù)乙草胺的免疫膠體金檢測卡內(nèi)的試紙條的剖視結(jié)構(gòu)圖，圖中7.樣品墊8.膠體金結(jié)合墊9.PVC膠板10.硝酸纖維素膜11.吸水墊。具體實(shí)施方式實(shí)施例1圖1、圖2所示的實(shí)施例：圖中9為PVC膠板；7為樣品墊；8為膠體金結(jié)合墊，該膠體金結(jié)合墊上包被了單克隆抗體膠體金標(biāo)記物；10為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜上包被了乙草胺-BSA和羊抗鼠IgG；11為吸水墊，由吸水材料如濾紙制成。在PVC膠板9的一端上(樣品端)粘附樣品墊7、結(jié)合墊8，樣品墊7和結(jié)合墊8為并排結(jié)構(gòu)。在PVC膠板9的中間粘附硝酸纖維素膜10。在硝酸纖維素膜10上設(shè)置有羊抗鼠IgG質(zhì)控線3和乙草胺-BSA檢測線2。在PVC膠板9的另一端粘附吸水墊11。硝酸纖維素膜10的一端與結(jié)合墊8略交叉，另一端與吸水墊11略交叉。該試紙條5可裝入有塑料模具制成的檢測卡外殼6中，制成檢測卡，在檢測卡外殼6的上蓋上設(shè)有加樣孔1和檢測孔4，樣品墊7正對加樣孔1，硝酸纖維素膜10正對檢測孔4。實(shí)施例2乙草胺膠體金檢測卡制備，是由以下步驟具體實(shí)現(xiàn)：膠體金溶液制備：取1L三角燒瓶1個(gè)，加入超純水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時(shí)，維持5min后停止加熱，補(bǔ)水至原體積，冷卻至室溫，2-8℃保存?zhèn)溆茫豢贵w的預(yù)處理：將要標(biāo)記的乙草胺抗體在1000r/min,4℃條件下，離心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/ml，過0.22μm濾膜；膠體金標(biāo)記物的制備：取步驟(1)中的膠體金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8.5，電磁攪拌器250r/min攪拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應(yīng)10min；逐滴加入4mL10%BSA，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10min；金標(biāo)抗體溶液常溫低速（1500r/min）離心10min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4℃，12000r/min離心20min，棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至1mL，制備成乙草胺單克隆抗體膠體金標(biāo)記物；膠體金膜的制備：將步驟(3)乙草胺蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用劃膜儀以5μL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37℃烘干3h，制成含乙草胺蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜；包被膜制備：將羊抗鼠IgG抗體、乙草胺蛋白質(zhì)偶聯(lián)物稀釋成1mg/mL，用劃膜儀依次以1μL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37℃包被2h后，室溫自然晾干或者37℃烘干；樣品墊前處理：將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；檢測卡的組裝：PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
乙草胺膠體金檢測卡，其特征在于按照下述步驟制備得到：(1)膠體金溶液制備：取1?L?三角燒瓶1個(gè)，加入超純水495?mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4·3H2O)5?mL，配制成500?mL?0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉Na3C6H5O7·2H2O溶液5?7?mL，繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時(shí)，維持5?min后停止加熱，補(bǔ)水至原體積，冷卻至室溫，2?8℃保存?zhèn)溆茫?2)抗體的預(yù)處理：將要標(biāo)記的乙草胺抗體在1000?r/min，4℃條件下，離心20?min，取上清，用0.01?mol/L?PBS稀釋成1?mg/mL；或者用0.01?mol/L?PBS稀釋成1?mg/ml，過0.22?μm濾膜；(3)膠體金標(biāo)記物的制備：取步驟(1)中的膠體金溶液40?mL，用0.25?mol/L?K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至?8.5，電磁攪拌器250?r/min攪拌，逐滴加入4?mL?含0.3?mg?抗體蛋白的蛋白溶液，反應(yīng)10?min；逐滴加入4?mL?10%?BSA，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10?min；金標(biāo)抗體溶液常溫1500?r/min離心10?min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4℃，12000?r/min?離心20?min，棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至1?mL，制備成乙草胺單克隆抗體膠體金標(biāo)記物；(4)膠體金膜的制備：將步驟(3)乙草胺蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用劃膜儀以5?μL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37℃烘干3?h，制成含乙草胺蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜；(5)包被膜制備：將羊抗鼠IgG抗體、乙草胺蛋白質(zhì)偶聯(lián)物稀釋成1?mg/mL，用劃膜儀依次以1?μL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37℃包被2?h后，室溫自然晾干或者37℃烘干；(6)樣品墊前處理：將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；(7)檢測卡的組裝：PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。...

【技術(shù)特征摘要】
1.乙草胺膠體金檢測卡，其特征在于按照下述步驟制備得到：(1)膠體金溶液制備：取1L三角燒瓶1個(gè)，加入超純水495mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉Na3C6H5O7·2H2O溶液5-7mL，繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時(shí)，維持5min后停止加熱，補(bǔ)水至原體積，冷卻至室溫，2-8℃保存?zhèn)溆茫?2)抗體的預(yù)處理：將要標(biāo)記的乙草胺抗體在1000r/min，4℃條件下，離心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/ml，過0.22μm濾膜；(3)膠體金標(biāo)記物的制備：取步驟(1)中的膠體金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8.5，電磁攪拌器250r/min攪拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應(yīng)10min；逐滴加入4mL10%BSA，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10min；金標(biāo)抗體溶液常溫1500r/min離心10min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4℃，12000r/min離心20min...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：杜霞，洪霞，張淑雅，
申請(專利權(quán))人：江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32