針對MMP9的特異性抗體制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及結(jié)合MMP9并包含抗體的重鏈可變區(qū)的至少一個(gè)片段和/或輕鏈可變區(qū)的至少一個(gè)片段的新蛋白質(zhì)。特別地，根據(jù)本發(fā)明專利技術(shù)的MMP9結(jié)合蛋白能夠中和MMP9活性并且可用于預(yù)防和/或治療炎癥和/或自身免疫性疾病或癌癥。特別地，根據(jù)本發(fā)明專利技術(shù)的MMP9結(jié)合蛋白可用于診斷MMP9相關(guān)病癥。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及特異性結(jié)合并中和所述蛋白質(zhì)的活性的抗體及其片段，以及其作為治療劑或診斷劑的用途。
技術(shù)介紹
基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族由至少23種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的、可溶性或膜結(jié)合的鋅依賴性內(nèi)肽酶組成，其廣泛參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的重塑和各種生物活性分子的功能調(diào)節(jié)。所有MMP具有原型結(jié)構(gòu)，其包括維持MMP為無活性形式的前結(jié)構(gòu)域和作用于廣譜細(xì)胞外基質(zhì)組分的催化結(jié)構(gòu)域。基質(zhì)金屬肽酶9(MMP9)也稱為92kDaIV型膠原酶或明膠酶B(GELB)，是MMP家族酶的成員，其負(fù)責(zé)降解變性和基底膜膠原(Agrawaletal.,2006J.Exp.Med.203,1007–1019)和通過加工可溶性蛋白質(zhì)促進(jìn)炎癥，可溶性蛋白質(zhì)包括蛋白酶抑制劑(Liuetal.,2000,J.Exp.Med.188,475–482.)、趨化因子(VandenSteenetal.,2000,LancetNeurol.2,747–756)和細(xì)胞因子(Nelissenetal.,2003,Brain126,1371–1381)。MMP9還通過膜結(jié)合分子(如生長因子前體和受體、酪氨酸激酶受體(TKR)、細(xì)胞粘附分子(Bauvois,2012,BiochimBiophysActa.1825(1):29-36.))的蛋白水解來控制腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。在疾病中，MMP9由包括白細(xì)胞的許多細(xì)胞類型分泌，例如嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，以及成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞(Vandoorenetal.,2013,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.48(3):222-72)。MMP9的一般結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)包含分泌前導(dǎo)序列、催化潛伏所需的抑制性前體結(jié)構(gòu)域、含有三個(gè)纖連蛋白II型重復(fù)環(huán)的“分裂”催化結(jié)構(gòu)域，其一起形成膠原結(jié)合域(CBD)、富含高糖基化脯氨酸的連接體(也稱為OG結(jié)構(gòu)域)和血紅素結(jié)合蛋白樣C-末端結(jié)構(gòu)域(PEX)。基質(zhì)金屬肽酶2(MMP2)，也稱為72kDaIV型膠原酶或明膠酶A(GELA)，是屬于與MMP9相同家族的酶。MMP2和MMP9表現(xiàn)出高氨基酸序列同一性(在全長蛋白上為45.9％，在催化結(jié)構(gòu)域上為63.2％)，并且共享高度相似的3D結(jié)構(gòu)，特別是在它們的催化結(jié)構(gòu)域中。因此，由于這種高結(jié)構(gòu)和氨基酸序列同源性，鑒定對人MMP2具有選擇性的抑制性抗人MMP9抗體是非常困難的(Morgunovaetal.,1999,Science,284:1667-1670)。許多急性炎癥和自身免疫性疾病狀態(tài)、纖維化病癥和侵襲性癌癥與過量MMP9的存在相關(guān)(Huetal,2007,NatureReviewsDrugDiscovery,6,480-498；Rametal,2006,J.Clin.Immunol.,(26)4:299-307；AiZheng,2003,Chinesejournalofcancer,22(2):178-84；Baughetal,1999,Gastroenterology,117:814-822；Santosetal,2013,BiochemBiophysResCommun.,438(4):760-4)；Herszényietal,2012,Int.J.Mol.Sci.,13,13240-13263；Lijnen,2001,ThrombHaemost,86:324-33；Roselletal.,2005,Stroke36:1415–20；Whatlingetal.,2004,ArteriosclerThrombVascBiol.,24:10–11；Yasminetal.,2005,ArteriosclerThrombVascBiol.,25:372-8；Vassiliadisetal.,2011,BMCDermatol.,11:6)，因此，該酶作為治療性干預(yù)的預(yù)期目標(biāo)已經(jīng)受到相當(dāng)大的關(guān)注。強(qiáng)大的臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，MP9水平升高與癌癥發(fā)展、轉(zhuǎn)移和縮短的患者存活時(shí)間相聯(lián)，因?yàn)樗ㄟ^消化基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)組分在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。與人嗜中性粒細(xì)胞中的MMP9共價(jià)連接的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)(Triebeletal.,1992,FEBSLett.,314,386–388)保護(hù)MMP9免受蛋白水解降解并增加MMP9的酶活性和隨后增強(qiáng)腫瘤侵襲和擴(kuò)散(Yanetal.,2001,J.Biol.Chem.,276,37258–37265)。血清中高濃度的MMP9/NGAL復(fù)合物與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中較短的無進(jìn)展生存期和較差的總生存期相關(guān)(Perrinetal.,2011,Prog.EnUrol.J.Assoc.Fr.Urol.SociétéFr.Urol.,21,851–858)。特別地，MMP-9的作用與結(jié)腸直腸癌(Herszényietal.,2012,IntJMolSci,.13(10):13240-63)、胰腺癌(Gaoetal.,2015,MedOncol.32(1):418)、乳腺癌(Kimetal.,2014,BMCCancer.14(1):959)、肺癌(Ruiz-Moralesetal.,TumourBiol.36(5):3601-10)、卵巢癌(Nayloretal.,1994,IntJCancer,58:50-6)、膀胱癌(Szarvasetal.,2011,NatRevUrol.,8(5):241-54)和胃癌(Chenetal.,2015,IntJClinExpMed.8(1):546-57)相關(guān)。MMP9的作用已經(jīng)在免疫病理學(xué)中特別是在炎癥性腸病(IBD)中顯示，其中MMP9被報(bào)道為在活性發(fā)炎的腸粘膜中表達(dá)最豐富的MMP，并且其表達(dá)與疾病活性良好地相關(guān)(Naito和Yoshikawa,2005,26:379-390)。在IBD中，認(rèn)為MMP9在不充分組織的重塑與促炎細(xì)胞因子和趨化因子的激活中起關(guān)鍵作用，從而使得能夠募集活化的白細(xì)胞(Nuala等人，2014,Inflamm.Bowel0:1-15)。更具體地，在克羅恩氏病(CD)患者中報(bào)道了沿肛管瘺的瘺管上增強(qiáng)的MMP9表達(dá)和瘺管活檢中增加的MMP9活性，這支持MMP9可能有助于形成代表CD的嚴(yán)重并發(fā)癥的瘺的假設(shè)(Efsen等人，2011,BasicClinPharmacolToxicol.109(3)：208-16)。此外，降低的NGAL/MMP9血清水平也與用英夫利昔單抗治療的潰瘍性結(jié)腸炎患者的粘膜愈合相關(guān)(deBruyn等人，2014,Inflamm.BowelDis.,20,1198-1207)。MMP9的作用與多種神經(jīng)性疾病有關(guān)，例如阿爾茨海默氏病(Mroczkoetal.,2013,J.AlzheimersDis.,37(2):273-278)、多發(fā)性硬化(Mirshafieyetal.,2014,SultanQaboosUnivMedJ,,14(1),13-25)、神經(jīng)炎癥或腦缺血(Candelario-Jaliletal.,2009,Neuroscience158(3):983-94)。在阿爾茨海默氏病中，對決策腦區(qū)域中tau寡本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種對MMP9有特異性的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述抗體或其片段通過與包含由SEQ?ID?NO：41組成的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸、由SEQ?ID?NO：42組成的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸和由SEQ?ID?NO：43組成的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸的表位相互作用而結(jié)合至MMP9，其中，所述區(qū)域在人MMP9的催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2014.08.13 EP 14180765.11.一種對MMP9有特異性的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述抗體或其片段通過與包含由SEQIDNO：41組成的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸、由SEQIDNO：42組成的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸和由SEQIDNO：43組成的區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸的表位相互作用而結(jié)合至MMP9，其中，所述區(qū)域在人MMP9的催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的抗體或其片段，，包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含：(i)SEQIDNO：2的重鏈CDR1或其變體，其中，所述重鏈CDR1的1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸取代；(ii)SEQIDNO：3的重鏈CDR2或其變體，其中，所述重鏈CDR2的1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸取代；(iii)SEQIDNO：4的重鏈CDR3或其變體，其中，所述重鏈CDR3的1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸取代。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離的抗體或其片段，其中，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：11或其變體，其中，重鏈CDR1、CDR2和/或CDR3中的至少一個(gè)的1、2或3個(gè)氨基酸，和/或重鏈可變框架區(qū)的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸被不同的氨基酸取代。4.根據(jù)權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其片段，其中，所述重鏈可變區(qū)包含選自以下的氨基酸序列：(i)氨基酸序列SEQIDNO：12(ii)氨基酸序列SEQIDNO：13(iii)氨基酸序列SEQIDNO：14(iv)氨基酸序列SEQIDNO：15(v)氨基酸序列SEQIDNO：16(vi)氨基酸序列SEQIDNO：17(vii)氨基酸序列SEQIDNO：18(viii)氨基酸序列SEQIDNO：19(ix)氨基酸序列SEQIDNO：20，(x)氨基酸序列SEQIDNO：11。5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其片段，還包含選自以下的輕鏈可變區(qū)：a)輕鏈可變區(qū)，包含：(i)SEQIDNO：21的輕鏈CDR1或其變體，其中，所述輕鏈CDR1的1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸取代；(ii)SEQIDNO：22的輕鏈CDR2或其變體，其中，所述輕鏈CDR2的1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸取代；(iii)SEQIDNO：23的輕鏈CDR3或其變體，其中，所述輕鏈CDR3的1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸取代，或b)輕鏈可變區(qū)，包含：(i)SEQIDNO：26的輕鏈CDR1或其變體，其中，所述輕鏈CDR1的1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸取代；(ii)SEQIDNO：27的輕鏈CDR2或其變體，其中，所述輕鏈CDR2的1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸取代；(iii)SEQIDNO：28的輕鏈CDR3或其變體，其中，所述輕鏈CDR3的1、2或3個(gè)氨基酸被不同的氨基酸取代。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離的抗體或其片段，其中，所述輕鏈可變區(qū)包含選自以下的氨基酸序列：(1)SEQIDNO：24或其變體，其中，輕鏈CDR1、CDR2和/或CDR3的至少一個(gè)的1、2或3個(gè)氨基酸，和/或輕鏈可變框架區(qū)的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸被不同的氨基酸取代，和(2)SEQIDNO：29或其變體，其中，輕鏈CDR1、CDR2和/或CDR3的至少一個(gè)的1、2或3個(gè)氨基酸，和/或所述輕鏈可變框架區(qū)的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸被不同的氨基酸取代。7.根據(jù)權(quán)利要求5-6中任一項(xiàng)所述的分離的抗體或其片段，其中，所述輕鏈可變區(qū)包含選自以下的氨基酸序列：(i)SEQIDNO：67的氨基酸序列，(ii)SEQIDNO：68的氨基酸序列，(iii)SEQIDNO：69的氨基酸序...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：約蘭德·赫瓦特奇科·米索頓，勞倫斯·戈芬，奧利維爾·萊格爾，史蒂文·M·鄧恩，克莉絲汀·鮑爾，金賽·孟德雷爾，
申請(專利權(quán))人：克里普索生物科技公司，默克專利有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：瑞士;CH