基于多功能化二硫化鉬的miRNA-21電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了基于多功能化二硫化鉬的miRNA?21電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用，特點(diǎn)是包括將制備的Fe3O4磁性納米顆粒進(jìn)行氨基化，然后與氯金酸反應(yīng)制備Fe3O4@Au磁性納米顆粒的步驟；將制備的單片層MoS2進(jìn)行羧基化，后依次與偶聯(lián)試劑、信號DNA溶液和魯米諾溶液反應(yīng)，最后加入巰基己醇溶液震蕩清洗得到信號單元溶液的步驟；將Fe3O4@Au與捕獲DNA溶液反應(yīng)得到捕獲單元溶液的步驟；最后將捕獲單元溶液滴涂于磁性玻碳電極表面，然后依次將miRNA?21、信號單元溶液滴涂于磁性玻碳電極表面即可，優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高以及操作步驟簡單，實(shí)驗(yàn)成本低。

Preparation method of multifunctional miRNA MoS2 21 electrochemiluminescence immunosensor and its application based on

The invention discloses a preparation method and application of multi function miRNA MoS2 21 electrochemiluminescence immunosensor based on features including Fe3O4 magnetic nanoparticles prepared by amination and preparation of Fe3O4@Au magnetic nanoparticles and HAuCl4 reaction steps were carboxylated; will MoS2 the preparation of monolithic layer after, in turn with the coupling reagent, signal DNA solution and Lumino solution reaction, finally adding 6-mercapto-1-hexanol solution shock cleaning solution step signal unit; Fe3O4@Au and DNA will capture the solution reaction capture unit solution steps; finally the capture unit solution onto the surface of magnetic glassy carbon electrode, then miRNA 21, signal unit solution drop onto the magnetic glassy carbon electrode surface, has the advantages of high sensitivity, strong specificity, high accuracy and simple operation steps, Low experimental cost.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器及其檢測方法，尤其是涉及一種基于多功能化二硫化鉬材料的miRNA-21電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用，屬于功能材料和生物傳感

技術(shù)介紹
癌癥，也稱惡性腫瘤，本質(zhì)上是一種多基因疾病，是由細(xì)胞生長增殖機(jī)制失常引起的疾病，嚴(yán)重危害人類的健康。據(jù)WHO報(bào)告與預(yù)測，全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增長態(tài)勢，由2012年的1400萬人，逐年遞增至2025年的1900萬人，到2035年將達(dá)到2400萬人。腫瘤專家認(rèn)為，實(shí)現(xiàn)對腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療，可以有效地預(yù)防癌癥，其中早期診斷是關(guān)鍵。腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)使得早期診斷成為可能。腫瘤標(biāo)志物是在腫瘤的發(fā)生和增殖過程中產(chǎn)生、反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)，因此，檢測腫瘤標(biāo)志物對癌癥患者有極其重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，人體的很多腫瘤中都存在miRNA的差異表達(dá)，在這些差異表達(dá)中miRNA-21較為特殊，高表達(dá)的miRNA-21發(fā)揮著原癌基因的作用，一旦被激活，就會誘導(dǎo)或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此，miRNA-21可作為有效的腫瘤標(biāo)志物。目前miRNA-21的檢測方法主要有Northern印跡分析、微陣列芯片法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和原位雜交法等。Northern印記分析操作繁瑣、耗時(shí)長、靈敏度低，檢測時(shí)需要大量樣品，并且對RNase污染非常敏感，實(shí)驗(yàn)中每一步操作不當(dāng)都會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；實(shí)時(shí)熒光定量PCR的低選擇性和非線性目標(biāo)的放大可能會導(dǎo)致基因表達(dá)的失真，只能用來量化miRNA前體的表達(dá)，而不能量化成熟的miRNA表達(dá)；微陣列芯片制作和檢測費(fèi)用很高，芯片上可利用體積很小，導(dǎo)致靈敏度不高。因此，建立一種靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡便的miRNA-21檢測方法是迫切需求。電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法是電化學(xué)發(fā)光和免疫分析相結(jié)合的產(chǎn)物，它具有靈敏度高、響應(yīng)快速、選擇性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、易于操作、步驟簡單等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。二硫化鉬（MoS2）是一類與石墨烯有著類似結(jié)構(gòu)的層狀無機(jī)化合物，具有較大的比表面積、良好的導(dǎo)電性以及較好的化學(xué)穩(wěn)定性，其在電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器方面受到關(guān)注。目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于基于多功能化二硫化鉬的miRNA-21電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用的相關(guān)研究報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種靈敏度高，特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高以及操作步驟簡單，實(shí)驗(yàn)成本低的基于多功能化二硫化鉬的miRNA-21電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用。本專利技術(shù)解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種基于多功能化二硫化鉬的miRNA-21電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟：（1）Fe3O4@Au磁性納米顆粒的制備a.制備Fe3O4磁性納米顆粒：將0.7～1.0gFeCl3·6H2O和0.2～0.5gFeCl2·4H2O溶于50～100mL的二次水后加入到三口燒瓶中，通氮?dú)猓帕嚢杌旌暇鶆颍瑴囟壬叩?0～100℃，向三口燒瓶中緩慢滴加20～25wt%的氨水，調(diào)節(jié)pH=9～10，繼續(xù)加熱攪拌1～2h后，停止加熱，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，攪拌回流，冷卻至室溫，制備得到的黑色沉淀物即為Fe3O4磁性納米顆粒，用二次水清洗至中性，乙醇中定容至50mL；b.制備氨基化的Fe3O4磁性納米顆粒：將步驟a所制備的Fe3O4磁性納米顆粒溶液超聲0.5～1h，加入0.2～0.3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），攪拌4～5h，加入1～2mL0.1～0.5mol/L硝酸溶液，繼續(xù)攪拌3～4h后，得到氨基化的Fe3O4磁性納米顆粒，清洗3～5次，乙醇中定容至100mL；c.制備Fe3O4@Au磁性納米顆粒：將5～10mL步驟b所制備的氨基化的Fe3O4磁性納米顆粒溶液和10～20mL1wt%HAuCl4在60～100kHz的超聲頻率下混合，攪拌1h后，緩慢加入30～50mL20～30mmol/L檸檬酸三鈉溶液，超聲2～3h，得到Fe3O4@Au磁性納米顆粒，二次水清洗，定容至20mL；（2）信號單元（(signalDNA&luminol)@MoS2）的合成a.制備單片層MoS2：稱取0.8～1gMoS2粉末加入高壓釜，隨后加入30～35mL0.4～0.5mol/L的正丁基鋰正己烷溶液，將高壓釜密封后放在100℃真空干燥箱中反應(yīng)4～5h，獲得的產(chǎn)物過濾洗滌，在60℃真空烘箱中干燥得到鋰離子插層的二硫化鉬；取0.1～0.2g鋰離子插層的二硫化鉬分散在200～300mL水中，室溫下超聲4～5h，得到單分子層的MoS2水溶液，冷凍干燥后得到MoS2粉末；b.制備羧基化MoS2：將0.04～0.05g步驟a所制備的MoS2粉末加入到40～50mL30～40mmol/L的半胱氨酸溶液中，在超聲儀中超聲2～3h，低速離心除去未完全剝離的MoS2，最終獲得羧基化的MoS2納米片層；c.合成信號單元（(signalDNA&luminol)@MoS2）：取100～200μL1～2mg/mL羧基化的MoS2納米片層溶液超聲1h，加入200～400μL偶聯(lián)試劑，混合均勻，用0.5～1.0mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH為4～6，常溫震蕩30～40min，離心洗滌去除上清液以去除多余的偶聯(lián)試劑，取沉淀定容至200～300μL；加入20～30μL1～5μmol/L信號DNA（signalDNA）溶液和20～30μL0.05～0.1mol/L魯米諾（luminol）溶液，用1～2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH為9～10，混合均勻，常溫震蕩3～4h；最后加入10～20μL10～20mmol/L巰基己醇（MCH）溶液封閉非特異性吸附位點(diǎn)，繼續(xù)震蕩1～2h，用二次水清洗離心去除上清液以去除剩余的MCH、未結(jié)合的signalDNA和luminol，最后將沉淀分散在雜交緩沖液中定容至30～50μL，即得到信號單元（(signalDNA&luminol)@MoS2）溶液；（3）捕獲單元（Fe3O4@Au-captureDNA）的合成取50～100μLFe3O4@Au溶液超聲5～10min，加入20～50μL1～5μmol/L捕獲DNA（captureDNA）溶液，用DNA固定緩沖液定容至200μL，混合均勻，37℃下震蕩3～4h，暗處放置24h，利用Au-S鍵合作用，captureDNA自組裝在Fe3O4@Au的表面，清洗去掉未結(jié)合的captureDNA；滴加10～20μL10～20mmol/L巰基己醇溶液封閉非特異性吸附位點(diǎn)，用水清洗離心去上清以去除多余的MCH，取沉淀用水定容至100μL，即得到捕獲單元（Fe3O4@Au-captureDNA）溶液，4℃下保存?zhèn)溆?；?）電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器組裝a.將直徑為3～5mm磁性玻碳電極依次用0.1、0.3、0.05μmol/LAl2O3漿拋光成鏡面，依次用無水乙醇、蒸餾水超聲波清洗，N2吹干；b.取5～10μL捕獲單元（Fe3O4@Au-captureDNA）溶液滴涂于上述預(yù)處理過的磁性玻碳電極表面，通過磁性作用，捕獲單元即被牢固地吸附在電極表面，然后將5～10μLmiRNA-21溶液滴涂在電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器上，置于37℃中孵育1～2h，清洗；再取5～10μL步驟（2）所得本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種基于多功能化二硫化鉬的miRNA?21電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟：（1）Fe3O4@Au磁性納米顆粒的制備a.?制備Fe3O4磁性納米顆粒：將0.7～1.0?g?FeCl3·6H2O和0.2～0.5?g?FeCl2·4H2O溶于50～100?mL的二次水后加入到三口燒瓶中，通氮?dú)猓帕嚢杌旌暇鶆?，溫度升高?0～100℃，向三口燒瓶中緩慢滴加20～25wt%的氨水，調(diào)節(jié)pH=9～10，繼續(xù)加熱攪拌1～2?h后，停止加熱，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，攪拌回流，冷卻至室溫，制備得到的黑色沉淀物即為Fe3O4磁性納米顆粒，用二次水清洗至中性，乙醇中定容至50?mL；b.?制備氨基化的Fe3O4磁性納米顆粒：將步驟a所制備的Fe3O4磁性納米顆粒溶液超聲0.5～1?h，加入0.2～0.3?mL?3?氨丙基三乙氧基硅烷，攪拌4～5?h，加入1～2?mL?0.1～0.5?mol/L硝酸溶液，繼續(xù)攪拌3～4?h后，得到氨基化的Fe3O4磁性納米顆粒，清洗3～5次，乙醇中定容至100?mL；c.?制備Fe3O4@Au磁性納米顆粒：將5～10?mL步驟b所制備的氨基化的Fe3O4磁性納米顆粒溶液和10～20?mL?1wt%HAuCl4在60～100?kHz的超聲頻率下混合，攪拌1?h后，緩慢加入30～50?mL?20～30?mmol/L檸檬酸三鈉溶液，超聲2～3?h，得到Fe3O4@Au磁性納米顆粒，二次水清洗，定容至20?mL；（2）信號單元的合成a.?制備單片層MoS2：稱取0.8～1?g?MoS2粉末加入高壓釜，隨后加入30～35?mL?0.4～0.5?mol/L的正丁基鋰正己烷溶液，將高壓釜密封后放在100℃真空干燥箱中反應(yīng)4～5?h，獲得的產(chǎn)物過濾洗滌，在60℃真空烘箱中干燥得到鋰離子插層的二硫化鉬；取0.1～0.2?g?鋰離子插層的二硫化鉬分散在200～300?mL水中，室溫下超聲4～5?h，得到單分子層的MoS2水溶液，冷凍干燥后得到MoS2粉末；b.?制備羧基化MoS2：將0.04～0.05?g步驟a所制備的MoS2粉末加入到40～50?mL?30～40?mmol/L的半胱氨酸溶液中，在超聲儀中超聲2～3?h，低速離心除去未完全剝離的MoS2，最終獲得羧基化的MoS2納米片層；c.?合成信號單元：取100～200?μL?1～2?mg/mL羧基化的MoS2納米片層溶液超聲1?h，加入200～400?μL偶聯(lián)試劑，混合均勻，用0.5～1.0?mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH為4～6，常溫震蕩30～40?min，離心洗滌去除上清液，取沉淀定容至200～300?μL；加入20～30?μL?1～5?μmol/L信號DNA溶液和20～30?μL?0.05～0.1?mol/L魯米諾溶液，用1～2?mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH為9～10，混合均勻，常溫震蕩3～4?h；最后加入10～20?μL?10～20?mmol/L巰基己醇溶液封閉非特異性吸附位點(diǎn)，繼續(xù)震蕩1～2?h，用二次水清洗離心去除上清液，最后將沉淀分散在雜交緩沖液中定容至30～50?μL，即得到信號單元溶液；（3）捕獲單元的合成取50～100?μL?Fe3O4@Au溶液超聲5～10?min，加入20～50?μL?1～5?μmol/L捕獲DNA溶液，用DNA固定緩沖液定容至200?μL，混合均勻，37℃下震蕩3～4?h，暗處放置24?h；然后滴加10～20?μL?10～20?mmol/L?巰基己醇溶液封閉非特異性吸附位點(diǎn)，用水清洗離心去上清以去除多余的MCH，取沉淀用水定容至100?μL，即得到捕獲單元溶液，4?℃下保存?zhèn)溆茫唬?）電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器組裝a.?將直徑為3～5?mm磁性玻碳電極依次用0.1、0.3、0.05?μmol/L?Al2O3漿拋光成鏡面，依次用無水乙醇、蒸餾水超聲波清洗，N2吹干；b.?取5～10?μL捕獲單元溶液滴涂于上述預(yù)處理過的磁性玻碳電極表面，通過磁性作用，捕獲單元即被牢固地吸附在電極表面，然后將5～10?μL?miRNA?21溶液滴涂在電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器上，置于37℃中孵育1～2?h，清洗；再取5～10?μL步驟（2）所得的信號單元溶液，置于37?℃中孵育1～2?h后，清洗得到基于多功能化二硫化鉬的miRNA?21電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于多功能化二硫化鉬的miRNA-21電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟：（1）Fe3O4@Au磁性納米顆粒的制備a.制備Fe3O4磁性納米顆粒：將0.7～1.0gFeCl3·6H2O和0.2～0.5gFeCl2·4H2O溶于50～100mL的二次水后加入到三口燒瓶中，通氮?dú)?，磁力攪拌混合均勻，溫度升高?0～100℃，向三口燒瓶中緩慢滴加20～25wt%的氨水，調(diào)節(jié)pH=9～10，繼續(xù)加熱攪拌1～2h后，停止加熱，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，攪拌回流，冷卻至室溫，制備得到的黑色沉淀物即為Fe3O4磁性納米顆粒，用二次水清洗至中性，乙醇中定容至50mL；b.制備氨基化的Fe3O4磁性納米顆粒：將步驟a所制備的Fe3O4磁性納米顆粒溶液超聲0.5～1h，加入0.2～0.3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，攪拌4～5h，加入1～2mL0.1～0.5mol/L硝酸溶液，繼續(xù)攪拌3～4h后，得到氨基化的Fe3O4磁性納米顆粒，清洗3～5次，乙醇中定容至100mL；c.制備Fe3O4@Au磁性納米顆粒：將5～10mL步驟b所制備的氨基化的Fe3O4磁性納米顆粒溶液和10～20mL1wt%HAuCl4在60～100kHz的超聲頻率下混合，攪拌1h后，緩慢加入30～50mL20～30mmol/L檸檬酸三鈉溶液，超聲2～3h，得到Fe3O4@Au磁性納米顆粒，二次水清洗，定容至20mL；（2）信號單元的合成a.制備單片層MoS2：稱取0.8～1gMoS2粉末加入高壓釜，隨后加入30～35mL0.4～0.5mol/L的正丁基鋰正己烷溶液，將高壓釜密封后放在100℃真空干燥箱中反應(yīng)4～5h，獲得的產(chǎn)物過濾洗滌，在60℃真空烘箱中干燥得到鋰離子插層的二硫化鉬；取0.1～0.2g鋰離子插層的二硫化鉬分散在200～300mL水中，室溫下超聲4～5h，得到單分子層的MoS2水溶液，冷凍干燥后得到MoS2粉末；b.制備羧基化MoS2：將0.04～0.05g步驟a所制備的MoS2粉末加入到40～50mL30～40mmol/L的半胱氨酸溶液中，在超聲儀中超聲2～3h，低速離心除去未完全剝離的MoS2，最終獲得羧基化的MoS2納米片層；c.合成信號單元：取100～200μL1～2mg/mL羧基化的MoS2納米片層溶液超聲1h，加入200～400μL偶聯(lián)試劑，混合均勻，用0.5～1.0mol/L鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH為4～6，常溫震蕩30～40min，離心洗滌去除上清液，取沉淀定容至200～300μL；加入20～30μL1～5μmol/L信號DNA溶液和20～30μL0.05～0.1mol/L魯米諾溶液，用1～2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH為9～10，混合均勻，常溫震蕩3～4h；最后加入10～20μL10～20mmol/L巰基己醇溶液封閉非特異性吸附位點(diǎn)，繼續(xù)震蕩1～2h，用二次水清洗離心去除上清液，最后將沉淀分散在雜交緩沖液中定容至30～50μL，即得到信號單元溶液；（3）捕獲單元的合成取50～100μLFe3O4@Au溶液超聲5～10min，加入20～50μL1～5μmol/L捕獲DNA溶液，用DNA固定緩沖液定容至200μL，混合均勻，37℃下震蕩3～4h，暗處放置24h；然后滴加10～20μL10～20mmol/L巰基己醇溶液封閉非特異性吸附位點(diǎn)，用水清洗離心去上清以去除多余的MCH，取沉淀用水定容至100μL，即得到捕獲單元溶液，4℃下...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：盧靜，郭智勇，胡宇芳，沙玉紅，武琳，俞欣辰，郭富米，
申請(專利權(quán))人：寧波大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33