α-淀粉酶的制備方法技術

本發明專利技術提供了α?淀粉酶的制備方法，其能解決現有技術中通過枯草芽孢桿菌制備α?淀粉酶后期純化步驟繁瑣、得到純品不易的技術問題。其包括以下步驟：（2）在α?淀粉酶基因上游添加e3?SD序列、下游添加組氨酸標簽，獲得改造后的α?淀粉酶基因；（3）將改造后的α?淀粉酶基因連接到載體pxmj19?aph213上，獲得重組表達載體pxmj19?aph213?amy；（4）將重組表達載體pxmj19?aph213?amy轉入谷氨酸棒桿菌，獲得重組菌；（5）培養重組菌，分泌表達α?淀粉酶；（6）α?淀粉酶的純化，包括：將含有α?淀粉酶的上清進行親和層析，介質為鎳柱。

Preparation method of alpha amylase

The present invention provides a method for preparing alpha amylase, which can solve the technical problems in the prior art by Bacillus subtilis preparation of alpha amylase post purification steps and obtain pure product is not easy. It includes the following steps: (2) add E3 SD sequence in the upstream and downstream added histidine tag alpha amylase gene, alpha amylase gene obtained after transformation; (3) the alpha amylase gene modified pxmj19 ligated to vector aph213, the recombinant expression vector pxmj19 Amy (aph213; 4) the recombinant expression vector pxmj19 aph213 Amy into Corynebacterium glutamicum, recombinant bacteria; (5) the cultivation of recombinant bacteria, secretory expression of alpha amylase; (6) purification, including alpha amylase: containing alpha amylase was used affinity chromatography medium, nickel column.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，具體涉及α-淀粉酶的制備方法。
技術介紹
α-淀粉酶是一種廣泛分布于動植物和微生物中，能水解淀粉、糖原等的α-1,4糖苷鍵，生成糊精和還原糖的一種酶，由于產物的末端殘基的碳原子構型為α構型，所以稱為α-淀粉酶。枯草芽孢桿菌是當今工業酶制劑生產應用最廣泛的菌種之一。研究資料表明，枯草芽孢桿菌能夠生成α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等十幾種酶，并且產酶量高、安全性好。因此，部分科研單位和企業通過枯草芽孢桿菌制備α-淀粉酶，該方法雖然產量高，但純化步驟繁瑣，得到純品不易。
技術實現思路
針對上述問題，本專利技術提供了α-淀粉酶的制備方法，其能解決現有技術中通過枯草芽孢桿菌制備α-淀粉酶后期純化步驟繁瑣、得到純品不易的技術問題。其技術方案是這樣的，其包括以下步驟：（1）獲取枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶基因，所述α-淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；（2）在所述α-淀粉酶基因上游添加e3SD序列、下游添加組氨酸標簽，獲得改造后的α-淀粉酶基因，所述e3SD序列如SEQIDNO：2所示；（3）將所述改造后的α-淀粉酶基因連接到載體pxmj19-aph213上，獲得重組表達載體pxmj19-aph213-amy，所述載體pxmj19-aph213的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；（4）將所述重組表達載體pxmj19-aph213-amy轉入谷氨酸棒桿菌，獲得重組菌；（5）培養所述重組菌，分泌表達α-淀粉酶；（6）α-淀粉酶的純化，包括：a、將重組菌的培養物進行離心，獲得含有α-淀粉酶的上清；b、將所述含有α-淀粉酶的上清進行親和層析，介質為鎳柱，獲得含有α-淀粉酶的洗脫液；c、將所述含有α-淀粉酶的洗脫液進行脫鹽，獲得純化的α-淀粉酶溶液。進一步的，步驟（6）中，親和層析中用于平衡、上樣的緩沖液A為：300mMNaCl，20mMTris，pH8.0的緩沖液，用于洗脫的緩沖液B為：300mMNaCl，250mM咪唑，20mMTris，pH8.0的緩沖液。進一步的，步驟（6）中，所述脫鹽的介質為脫鹽柱，優選為加萊克G25脫鹽柱。本專利技術的上述制備方法，其有益效果在于：（1）谷氨酸棒桿菌不產內毒素，安全性好；（2）本專利技術中的α-淀粉酶基因選自枯草芽孢桿菌，本身帶有信號肽，在表達過程中產生的α-淀粉酶能夠分泌到胞外，同時谷氨酸棒桿菌自身分泌到胞外的蛋白較少、無胞外蛋白酶，進而使得α-淀粉酶的純化操作簡便，而且α-淀粉酶在培養基中較為穩定；（3）α-淀粉酶的末端加有組氨酸標簽，只需一步親和層析純化便可以得到較純的α-淀粉酶，相對于從枯草芽孢桿菌培養物上清中純化α-淀粉酶較為簡單。附圖說明圖1為載體pxmj19-aph213的結構圖。圖2為α-淀粉酶的SDS-PAGE電泳圖，圖中泳道1為蛋白Marker，泳道2為谷氨酸棒桿菌上清，泳道3為含有α-淀粉酶的上清經過鎳柱純化后未被吸附的流串液，泳道4為含有α-淀粉酶的上清，泳道5為純化的α-淀粉酶溶液。具體實施方式枯草芽孢桿菌168（以下簡稱枯草芽孢桿菌）、谷氨酸棒桿菌ATCC13032（以下簡稱谷氨酸棒桿菌）和大腸桿菌DH5α（以下簡稱大腸桿菌）均購自中國高校工業微生物資源數據平臺；載體pxmj-19購自普如汀生物技術（北京）有限公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自Axygen，XhoI和HindIII內切酶、T4連接酶購自Thermo；鎳柱為1mlHis-Tag，購自Roche；脫鹽柱為G25脫鹽柱，購自加萊克。實驗例1α-淀粉酶的制備。（1）載體pxmj19-aph213的制備。載體pxmj19-aph213的結構如圖1所示，其構建過程如下：以引物aph213F和aph213R從載體xk99e載體上擴增出aph213基因，所用的引物如下：aph213F：ccggatatcagcttcacgctgccgcaagcacaph213R：ccgaagcttaattctgtttcctgtgtgaaattgPCR條件如下：95℃4min；95℃30s、62℃30s、72℃1min，35個循環；72℃7min。上述引物的設計使得aph213基因擴增過程中，在aph213基因上游形成EcoRV切點、下游形成HindIII切點，aph213的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；回收PCR產物并以EcoRV和HindIII酶切，通過T4DNA連接酶，連接到同樣經過EcoRV和HindIII酶切的載體pxmj-19上，獲得載體pxmj19-aph213。載體pxmj19-aph213的擴增過程如下：a、在50ml離心管中加入3ml的LB培養基，加入1.5ul的34mg/ml的氯霉素抗生素；b、挑取帶有載體pxmj19-aph213的大腸桿菌DH5α轉接至上述培養基中，在37℃，230rpm的條件下培養12h，以擴增pxmj19-aph213質粒；c、根據質粒提取試劑盒的說明書提取pxmj19-aph213質粒。（2）枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶基因的擴增與改造。以引物AmyF和AmyR從枯草芽孢桿菌的基因組上擴增出α-淀粉酶基因，所用的引物如下：AmyR：ccgctcgagtcagtggtggtggtggtggtgatggggaagagaaccgcttaag；AmyF：ccgaagcttgaaaggaggacctaatgtttgcaaaacgattcaaaacc；PCR條件如下：95℃4min；95℃30s、62℃30s、72℃2min，35個循環；72℃7min。上述引物的設計使得α-淀粉酶基因擴增過程中，在α-淀粉酶基因上游形成e3SD序列、下游形成組氨酸標簽，上游酶切位點為HindIII，下游酶切位點為XhoI，α-淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，e3SD序列如SEQIDNO：2所示；（3）構建重組載體。回收PCR產物并用XhoI和HindIII酶切，通過T4DNA連接酶，連接到同樣經過XhoI和HindIII酶切的載體pxmj19-aph213上，獲得重組表達載體pxmj19-aph213-amy，載體pxmj19-aph213的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。（4）構建重組菌。將重組表達載體pxmj19-aph213-amy轉入大腸桿菌中進行預擴增，培養基為LB培養基，氯霉素濃度為50ug/ml；提取后，用電轉化的方法轉入谷氨酸棒桿菌中，在LBHIS恢復培養基中30℃培養，氯霉素濃度為30ug/ml。（5）培養重組菌，分泌表達α-淀粉酶。將長出的轉化子轉接到裝有50ml培養基的250ml的三角瓶中進行培養，培養基為BHI培養基，培養條件為30℃，230rpm，48h。（6）α-淀粉酶的純化。a、將重組菌的培養物進行離心，12000rpm、4℃、5min，獲得含有α-淀粉酶的上清。b、將含有α-淀粉酶的上清進行親和層析，首先用緩沖液A平衡鎳柱，將含有α-淀粉酶的上清過濾并上樣至平衡后的鎳柱，繼續用緩沖液A平衡至基線水平后繼續平衡3個柱體積；用100mmol的B液洗脫，收集洗脫的洗脫液，每管收集0.5ml；緩沖液A為：300mMNaCl，20mMTris，pH8.0的緩沖液，緩沖液B為：3本文檔來自技高網...

【技術保護點】
α?淀粉酶的制備方法，其包括以下步驟：（1）獲取枯草芽孢桿菌的α?淀粉酶基因，所述α?淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；（2）在所述α?淀粉酶基因上游添加e3?SD序列、下游添加組氨酸標簽，獲得改造后的α?淀粉酶基因，所述e3?SD序列如SEQ?ID?NO：2所示；（3）將所述改造后的α?淀粉酶基因連接到載體pxmj19?aph213上，獲得重組表達載體pxmj19?aph213?amy，所述載體pxmj19?aph213的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；（4）將所述重組表達載體pxmj19?aph213?amy轉入谷氨酸棒桿菌，獲得重組菌；（5）培養所述重組菌，分泌表達α?淀粉酶；（6）α?淀粉酶的純化，包括：a、將重組菌的培養物進行離心，獲得含有α?淀粉酶的上清；b、將所述含有α?淀粉酶的上清進行親和層析，介質為鎳柱，獲得含有α?淀粉酶的洗脫液；c、將所述含有α?淀粉酶的洗脫液進行脫鹽，獲得純化的α?淀粉酶溶液。

【技術特征摘要】
1.α-淀粉酶的制備方法，其包括以下步驟：（1）獲取枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶基因，所述α-淀粉酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；（2）在所述α-淀粉酶基因上游添加e3SD序列、下游添加組氨酸標簽，獲得改造后的α-淀粉酶基因，所述e3SD序列如SEQIDNO：2所示；（3）將所述改造后的α-淀粉酶基因連接到載體pxmj19-aph213上，獲得重組表達載體pxmj19-aph213-amy，所述載體pxmj19-aph213的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；（4）將所述重組表達載體pxmj19-aph213-amy轉入谷氨酸棒桿菌，獲得重組菌；（5）培養所述重組菌，分泌表達α-淀粉...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉秀霞，張偉，白仲虎，楊艷坤，李詩潔，王世杰，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32