一種神經元特異性烯醇化酶穩定劑及其制備方法技術

本發明專利技術涉及神經元特異性烯醇化酶穩定劑，通過如下原料制備而成：Tris·HCl緩沖液、NaCl、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、牛血清白蛋白、PEG6000、賴氨酸、乙二胺四乙酸二鈉、二硫蘇糖醇、甘油、Tween?20、Triton?X?100、終濃度抑肽酶、Proclin?300，Millipore超純水作為溶劑，溶液混勻后用0.22μm濾膜過濾，0～10℃保存。本發明專利技術能大大提高神經元特異性烯醇化酶的保存穩定性，延長試劑盒的貨架壽命；簡化神經元特異性烯醇化酶檢測試劑盒的生產工藝及醫生檢測操作過程；提高了神經元特異性烯醇化酶配制、運輸和儲存過程中抗質變的能力；降低了由凍干工藝造成的批間差。

Neuron specific enolase stabilizer and preparation method thereof

The present invention relates to a neuron specific enolase stabilizer, prepared by the following: Tris, NaCl, HCl buffer, sucrose, trehalose, casein, bovine serum albumin, PEG6000, lysine, two sodium EDTA, two dithiothreitol, glycerol, Tween 20, Triton X 100 and the final concentration of aprotinin, Proclin 300, Millipore ultra pure water as solvent solution after mixing with 0.22 M filter membrane, 0 ~ 10 degrees to save. The invention can greatly improve the storage stability of neuron specific enolase, prolong the shelf life of the kit; production process and operation simplified doctors to detect neuron specific enolase detection kit; improve the neuron specific enolase preparation, transport and the ability of anti change during storage was reduced; caused by the difference between batches of freeze-drying process.

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于體外診斷試劑
，具體涉及一種神經元特異性烯醇化酶穩定劑及其制備方法。本專利技術提供的穩定劑用于NSE的保存，能夠顯著提高NSE化學性質的穩定，維持其空間構象，提高其耐熱性。
技術介紹
神經元特異性烯醇化酶（NeuronspecificEnolase,NSE）是烯醇化酶的一種同工酶，NSE基因核苷酸序列全長2423bp，開放讀碼框架從第226到1531個堿基，長度為1305bp，編碼全部434個氨基酸。NSE生物半衰期可能大約20小時，NSE分子量為78kDa，等電點為pH4.7，是一種酸性蛋白酶，主要參與糖酵解，催化2-磷酸甘油變成烯醇式磷酸丙酮酸。NSE廣泛分布于人類及各種動物的成熟神經元、周圍神經的神經內分泌細胞和一些感覺細胞中，正常人腦組織中含量最高，起源于神經內分泌細胞的腫瘤組織也有異常表達。常見于神經母細胞瘤、小細胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、嗜鉻細胞瘤等。正常情況下腦脊液和血清中只含有微量（約15ng/mL）NSE，但在腦血管意外、腦創傷、腦腫瘤等疾病時，NSE可增加到幾千ng/mL。NSE含量的升高是由于NSE分泌到神經細胞外或是由于神經元受損而釋放出細胞外，目前還不清楚。在起源于神經外胚層或神經內分泌組織的腫瘤病人血清、腦脊液中NSE水平升高，其中患小細胞肺癌和神經母細胞瘤的患者尤為明顯。目前NSE被認為是腦損傷（神經母細胞瘤、急性腦血管疾病、缺氧性損傷等）和小細胞肺癌（SCLC）的一項高特異性和高敏感性的生化指標，對小細胞肺癌病人和顱腦損傷病人的早期診斷、病情監測、療效評價等有重要價值。小細胞肺癌、神經母細胞瘤、神經內分泌細胞腫瘤（如嗜鉻細胞瘤、胰島細胞瘤、黑色素瘤）等疾病中NSE水平增高，檢測NSE可用于輔助診斷、病情監測、療效評價和復發預報。監測小細胞肺癌的復發，比臨床確定復發要早4～12周。NSE還可用于神經母細胞瘤和腎母細胞瘤的輔助診斷，前者NSE異常增高而后者增高不明顯。正是由于NSE的檢測在臨床上具有重要的應用價值，人們已經逐漸開發出用于NSE檢測的體外診斷試劑盒，但是通常情況下，NSE的生物半衰期大約為20h，難于長期穩定保存。為了解決此問題，人們一般采用冷凍干燥的技術，將NSE溶液制備成凍干粉，以解決NSE穩定性差，難以保存的問題。但是目前NSE的配置保存存在以下不足：（1）冷凍干燥技術需要用到冷凍干燥機，增加了設備投入和維護管理成本；（2）由于NSE極其不穩定，溶液配制過程中NSE活性容易衰減，加上冷凍干燥工藝本身穩定性較差，這樣會導不同批次間誤差較大。（3）對醫生使用來說，凍干粉在使用前需要復溶和混勻，增加了操作步驟和時間成本；復溶后的溶液保存周期短，如果復溶后短期內沒有使用完，則不可再用，會造成浪費。（4）NSE的不穩定，給企業生產增加了難度和提高了生產成本；給醫生使用帶來了不便；給患者增加了檢測成本。
技術實現思路
神經元特異性烯醇化酶（NeuronspecificEnolase,NSE）生物半衰期短，保存穩定性差，導致NSE保存穩定性差的原因的文獻研究報道不多。本申請專利技術人在大量實驗研究的基礎上，逐步弄清楚NSE保存穩定性差的原因，通過篩選上百種保存液配方，最終配置出了能夠使得NSE長期穩定保存的穩定劑。本專利技術解決上述問題所采用的技術方案為：一種神經元特異性烯醇化酶穩定劑，通過如下配比的原料制備而成：10～100mMTris·HCl緩沖液，pH7.4、3～6g/LNaCl、5～20g/L蔗糖、5～100g/L海藻糖、1～10g/L酪蛋白、5～50g/L牛血清白蛋白、1～30g/LPEG6000、0.1～1.5g/L賴氨酸、0.4～20g/L乙二胺四乙酸二鈉、0.5～10g/L二硫蘇糖醇、1%～10%（v/v）甘油、0.01%～0.5%（v/v）Tween-20、0.01%～0.5%（v/v）TritonX-100、終濃度100～300KIU/mL抑肽酶、0.02%～0.1%（v/v）Proclin300，Millipore超純水作為溶劑。配制步驟如下：1）稱取Tris，加入Millipore超純水溶解，配成50mM的Tris溶液，用鹽酸調節pH至7.4的緩沖溶液；2）依次稱取的NaCl、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、牛血清白蛋白、PEG6000、賴氨酸、乙二胺四乙酸二鈉、二硫蘇糖醇，溶解于Tris·HCl緩沖液；3）取甘油、Tween-20、TritonX-100、抑肽酶和Proclin300加入步驟2配制好的溶液中，充分攪拌溶解，溶液混勻后用0.22μm濾膜過濾，0～10℃保存本專利技術的穩定劑能夠使得極其不穩定的神經元特異性烯醇化酶液態下37℃恒溫放置7天活性下降小于10%，室溫（25℃）放置15天活性下降小于10%，4℃放置1年活性下降小于10%，從而顯著改善NSE體外診斷試劑盒貨架壽命，提高其商業價值。原理說明如下：（1）維持NSE本身化學結構不變：通過加入還原劑和抗氧化劑，防止NSE本身發生氧化還原反應，從而防止NSE本身化學結構發生改變。（2）維持NSE活性中心分子構象不變：通過加入單一的或復配的糖類、多羥基類、蛋白質類、氨基酸類、非離子型表面活性劑類等保護劑，通過氫鍵、靜電、疏水等作用力，以及通過增加空間位阻、提高體系粘度、提高NSE的玻璃化轉變溫度等方式來維持NSE活性中心的分子構象不變。（3）防止微生物及酶對NSE分子結構的破壞：通過加入防腐劑、酶抑制物來防止微生物及酶對NSE分子結構的破壞。所用抗氧劑乙二胺四乙酸二鈉的濃度優選為8g/L；防腐劑Proclin300的濃度優選為0.05%（v/v）。所用鹽種類為NaCl，優選濃度優選為5g/L。所用緩沖溶液Tris·HCl的濃度優選為50mM。所用糖類保護劑采用非還原性二糖蔗糖和海藻糖復配物，蔗糖濃度優選為10g/L，海藻糖濃度優選為50g/L。所用多羥基類保護劑為小分子的甘油和大分子的聚乙二醇（PEG6000）的復配物，甘油濃度優選為10%（v/v），PEG6000濃度優選為5g/L。所用蛋白類保護劑為酪蛋白和牛血清白蛋白的復配物，酪蛋白濃度優選為3g/L，牛血清白蛋白濃度優選為20g/L。所用氨基酸類保護劑為賴氨酸，賴氨酸濃度為1g/L。所用還原劑為二硫蘇糖醇，濃度優選為3g/L。非離子型表面活性劑采用Tween-20和TritonX-100的復配物，其中Tween-20濃度優選為0.1%（v/v）、TritonX-100濃度優選為0.2%（v/v）。所用抑肽酶的含量優選為150KIU/mL。與現有技術相比，本專利技術的優點在于：本專利技術的穩定劑能夠使得極其不穩定的神經元特異性烯醇化酶NSE液態下37℃恒溫放置7天活性下降小于10%，室溫（25℃）放置15天活性下降小于10%，4℃放置1年活性下降小于10%，從而顯著改善NSE體外診斷試劑盒貨架壽命，提高其商業價值。從生產企業角度看，無需配置冷凍干燥設備，NSE無需制成凍干粉，可以直接液態保存，節省了設備成本，簡化了產品配置工藝，同時提高了產品生產穩定性。從檢測醫師角度看，無需復溶，產品即開即用，且未一次性用完時，仍可以于4℃放置30天以上，保存期間可繼續使用，帶來方便的同時減本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種神經元特異性烯醇化酶穩定劑，其特征在于，通過如下配比的原料制備而成：10～100mM?Tris·HCl緩沖液，pH7.4、?3～6g/L?NaCl、5～20g/L蔗糖、5～100g/L海藻糖、1～10g/L酪蛋白、5～50g/L牛血清白蛋白、1～30g/L?PEG6000、0.1～1.5g/L賴氨酸、0.4～20g/L乙二胺四乙酸二鈉、0.5～10?g/L二硫蘇糖醇、1%～10%（v/v）甘油、0.01%～0.5%（v/v）Tween?20、0.01%～0.5%（v/v）Triton?X?100、終濃度100～300KIU/mL抑肽酶、0.02%～0.1%（v/v）Proclin?300，Millipore超純水作為溶劑；配制步驟如下：1）稱取Tris，加入Millipore超純水溶解，配成50mM的Tris溶液，用鹽酸調節pH至7.4的緩沖溶液；2）依次稱取的NaCl、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、牛血清白蛋白、PEG6000、賴氨酸、乙二胺四乙酸二鈉、二硫蘇糖醇，溶解于Tris·HCl緩沖液；3）取甘油、Tween?20、Triton?X?100、抑肽酶和Proclin?300加入步驟2配制好的溶液中，充分攪拌溶解，溶液混勻后用0.22μm濾膜過濾，0～10℃保存。...

【技術特征摘要】
1.一種神經元特異性烯醇化酶穩定劑，其特征在于，通過如下配比的原料制備而成：10～100mMTris·HCl緩沖液，pH7.4、3～6g/LNaCl、5～20g/L蔗糖、5～100g/L海藻糖、1～10g/L酪蛋白、5～50g/L牛血清白蛋白、1～30g/LPEG6000、0.1～1.5g/L賴氨酸、0.4～20g/L乙二胺四乙酸二鈉、0.5～10g/L二硫蘇糖醇、1%～10%（v/v）甘油、0.01%～0.5%（v/v）Tween-20、0.01%～0.5%（v/v）TritonX-100、終濃度100～300KIU/mL抑肽酶、0.02%～0.1%（v/v）Proclin300，Millipore超純水作為溶劑；配制步驟如下：1）稱取Tris，加入Millipore超純水溶解，配成50mM的Tris溶液，用鹽酸調節pH至7.4的緩沖溶液；2）依次稱取的NaCl、蔗糖、海藻糖、酪蛋白、牛血清白蛋白、PEG6000、賴氨酸、乙二胺四乙酸二鈉、二硫蘇糖醇，溶解于Tris·HCl緩沖液；3）取甘油、Tween-20、TritonX-100、抑肽酶和Proclin300加入步驟2配制好的溶液中，充分攪拌溶解，溶液混勻后用0.22μm濾膜過濾，0...

【專利技術屬性】
技術研發人員：譚建雄，奚偉紅，
申請(專利權)人：江蘇福隆生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32