本發明專利技術百菌清的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，涉及動物源食品獸藥殘留檢測技術領域。本發明專利技術的檢測卡外殼中的試紙條，由PVC膠板、樣品墊、膠體金結合墊、包被膜和吸水墊組成；膠體金膜為含百菌清單克隆抗體的玻璃纖維素膜，包被膜是硝酸纖維素膜，其上設有T線和C線，T線包被有百菌清蛋白質偶聯物，C線包被有羊抗鼠IgG抗體。本發明專利技術有效用于快速檢測百菌清，方便、快捷、結果準確。
Immune colloidal gold detection card of chlorothalonil and preparation method thereof
The invention relates to an immune colloidal gold detection card and a preparation method thereof. The detection card shell strip, coated membrane and absorbent pad is composed of PVC board, a sample pad, a colloidal gold combined pad, colloidal gold film; glass fibre membrane containing 100 bacteria list antibody coated membrane, nitrocellulose membrane is arranged on the T line and C line, T the line is coated with chlorothalonil protein conjugates, C line coated with Goat anti mouse IgG antibody. The invention is used for the rapid detection of chlorothalonil, which is convenient, rapid and accurate.
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及谷物食品中農藥殘留檢測
，特別是涉及百菌清的免疫膠體金檢測卡及其制備方法。
技術介紹
百菌清是具有高溫選擇性的水稻田專用除草劑。對水稻安全，殺草譜廣。雜草種子在發芽過程中吸收藥劑，根部吸收較差。該品為芽前除草劑，主要用于防除禾本科雜草。產品屬2-氯化乙酰替苯胺類除草劑，是細胞分裂抑制劑，用于土壤處理可防除稻田稗草、異型莎草、牛毛氈、鴨舌草、窄葉澤瀉等。具有一定的毒性，因此安全問題受到高度重視。國標中規定小麥中為0.1mg/kg。因此定期對百菌清殘留進行檢測成為許多國家的監控的必要手段。現有技術對于百菌清的檢測主要是氣相色譜-質譜法、高效液相色譜法等檢測方法，但這些技術的缺陷明顯：設備昂貴、操作復雜、難以推廣。所以，建立一種簡單、有效、適合基層使用的測定方法是極其必要的。本專利技術的目的是研制一種更適合企業進行現場檢測且快捷簡便、成本低廉的定性檢測方法。
技術實現思路
針對以上情況，本專利技術的目的就是為了克服現有技術存在的缺陷而提供一種百菌清的免疫膠體金檢測卡及其制備方法，可有效解決能快速、簡便地檢測出百菌清的問題。本專利技術的百菌清膠體金檢測卡，包括包被了單克隆抗體膠體金標記物的膠體金結合墊、包被了百菌清-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC膠板和塑料模具組成，在PVC膠板的一端依次粘附樣品墊、結合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。本專利技術的百菌清膠體金檢測卡的制備方法，是由以下步驟實現：(1)膠體金溶液制備：取1L三角燒瓶1個，加入超純水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8℃保存備用；(2)抗體的預處理：將要標記的百菌清抗體在1000r/min,4℃條件下，離心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/ml，過0.22μm濾膜；(3)膠體金標記物的制備：取步驟(1)中的膠體金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3調節膠體金溶液pH至8.5，電磁攪拌器250r/min攪拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10min；逐滴加入4mL10%BSA，繼續攪拌反應10min；金標抗體溶液常溫低速（1500r/min）離心10min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4℃，12000r/min離心20min，棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標抗體稀釋液定容至1mL，制備成百菌清單克隆抗體膠體金標記物；(4)膠體金膜的制備：將步驟(3)百菌清蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5μL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37℃烘干3h，制成含百菌清蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜；(5)包被膜制備：將羊抗鼠IgG抗體、百菌清蛋白質偶聯物稀釋成1mg/mL，用劃膜儀依次以1μL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37℃包被2h后，室溫自然晾干或者37℃烘干；(6)樣品墊前處理：將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；(7)檢測卡的組裝：PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。所述步驟(5)中所包被的檢測線T設在質控線C的下方；所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由1g小牛血清蛋白(BSA)和0.8g氯化鈉(NaCl)，用含有0.5%TRITON-100的0.01mol/LPBS定容至100mL；本專利技術可有效用于測定百菌清，方法簡單，方便、快捷，結果準確。附圖說明圖1為本專利技術百菌清的免疫膠體金檢測卡的結構圖：圖中1.加樣孔2.檢測線3.質控線4.檢測孔5.試紙條6.檢測卡外殼。圖2為本專利技術百菌清的免疫膠體金檢測卡內的試紙條的剖視結構圖，圖中7.樣品墊8.膠體金結合墊9.PVC膠板10.硝酸纖維素膜11.吸水墊。具體實施方式實施例1圖1、圖2所示的實施例：圖中9為PVC膠板；7為樣品墊；8為膠體金結合墊，該膠體金結合墊上包被了單克隆抗體膠體金標記物；10為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜上包被了百菌清-BSA和羊抗鼠IgG；11為吸水墊，由吸水材料如濾紙制成。在PVC膠板9的一端上(樣品端)粘附樣品墊7、結合墊8，樣品墊7和結合墊8為并排結構。在PVC膠板9的中間粘附硝酸纖維素膜10。在硝酸纖維素膜10上設置有羊抗鼠IgG質控線3和百菌清-BSA檢測線2。在PVC膠板9的另一端粘附吸水墊11。硝酸纖維素膜10的一端與結合墊8略交叉，另一端與吸水墊11略交叉。該試紙條5可裝入有塑料模具制成的檢測卡外殼6中，制成檢測卡，在檢測卡外殼6的上蓋上設有加樣孔1和檢測孔4，樣品墊7正對加樣孔1，硝酸纖維素膜10正對檢測孔4。實施例2百菌清膠體金檢測卡制備，是由以下步驟具體實現：膠體金溶液制備：取1L三角燒瓶1個，加入超純水495mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8℃保存備用；抗體的預處理：將要標記的百菌清抗體在1000r/min,4℃條件下，離心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/ml，過0.22μm濾膜；膠體金標記物的制備：取步驟(1)中的膠體金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3調節膠體金溶液pH至8.5，電磁攪拌器250r/min攪拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10min；逐滴加入4mL10%BSA，繼續攪拌反應10min；金標抗體溶液常溫低速（1500r/min）離心10min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4℃，12000r/min離心20min，棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標抗體稀釋液定容至1mL，制備成百菌清單克隆抗體膠體金標記物；膠體金膜的制備：將步驟(3)百菌清蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5μL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37℃烘干3h，制成含百菌清蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜；包被膜制備：將羊抗鼠IgG抗體、百菌清蛋白質偶聯物稀釋成1mg/mL，用劃膜儀依次以1μL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37℃包被2h后，室溫自然晾干或者37℃烘干；樣品墊前處理：將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；檢測卡的組裝：PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成本文檔來自技高網...
【技術保護點】
百菌清膠體金檢測卡，其特征在于按照下述步驟制備得到：(1)膠體金溶液制備：取1?L?三角燒瓶1個，加入超純水495?mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4·3H2O)5?mL，配制成500?mL?0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉Na3C6H5O7·2H2O溶液5?7?mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5?min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2?8℃保存備用；(2)抗體的預處理：將要標記的百菌清抗體在1000?r/min，4℃條件下，離心20?min，取上清，用0.01?mol/L?PBS稀釋成1?mg/mL；或者用0.01?mol/L?PBS稀釋成1?mg/ml，過0.22?μm濾膜；(3)膠體金標記物的制備：取步驟(1)中的膠體金溶液40?mL，用0.25?mol/L?K2CO3調節膠體金溶液pH至?8.5，電磁攪拌器250?r/min攪拌，逐滴加入4?mL?含0.3?mg?抗體蛋白的蛋白溶液，反應10?min；逐滴加入4?mL?10%?BSA，繼續攪拌反應10?min；金標抗體溶液常溫1500?r/min離心10?min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4℃，12000?r/min?離心20?min，棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標抗體稀釋液定容至1?mL，制備成百菌清單克隆抗體膠體金標記物；(4)膠體金膜的制備：將步驟(3)百菌清蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5?μL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37℃烘干3?h，制成含百菌清蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜；(5)包被膜制備：將羊抗鼠IgG抗體、百菌清蛋白質偶聯物稀釋成1?mg/mL，用劃膜儀依次以1?μL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37℃包被2?h后，室溫自然晾干或者37℃烘干；(6)樣品墊前處理：將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；(7)檢測卡的組裝：PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。...
【技術特征摘要】
1.百菌清膠體金檢測卡，其特征在于按照下述步驟制備得到：(1)膠體金溶液制備：取1L三角燒瓶1個，加入超純水495mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4·3H2O)5mL，配制成500mL0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉Na3C6H5O7·2H2O溶液5-7mL，繼續攪拌加熱，當溶液的顏色完全變為透明的紫紅色時，維持5min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8℃保存備用；(2)抗體的預處理：將要標記的百菌清抗體在1000r/min，4℃條件下，離心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/mL；或者用0.01mol/LPBS稀釋成1mg/ml，過0.22μm濾膜；(3)膠體金標記物的制備：取步驟(1)中的膠體金溶液40mL，用0.25mol/LK2CO3調節膠體金溶液pH至8.5，電磁攪拌器250r/min攪拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10min；逐滴加入4mL10%BSA，繼續攪拌反應10min；金標抗體溶液常溫1500r/min離心10min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4℃，12000r/min離心20min...
【專利技術屬性】
技術研發人員：杜霞，杜軍，劉靜，
申請(專利權)人：江蘇維賽科技生物發展有限公司，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
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