基于不對稱AS2-PCR的基因變異檢測方法及引物技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種基于不對稱AS2?PCR的基因變異檢測方法，步驟包括：1)提取樣本DNA；2)擴(kuò)增待測基因片段；3)將擴(kuò)增產(chǎn)物加到不對稱AS2?PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)和探針外切反應(yīng)；所述AS2?PCR反應(yīng)體系含有2條帶熒光標(biāo)記的通用標(biāo)簽信號探針、2條正向引物、1條反向引物、有外切活性的聚合酶和PCR緩沖液；4)檢測反應(yīng)的熒光信號，計(jì)算兩個(gè)通道的Ct差值，并根據(jù)Ct差值判斷待測基因SNP。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了用于上述方法的不對稱AS2?PCR寡核苷酸引物組及其用途。本發(fā)明專利技術(shù)通過設(shè)計(jì)不對稱AS2?PCR的引物，克服了傳統(tǒng)AS2?PCR假陽性率高的問題，提高了基因變異檢測的準(zhǔn)確性。

Gene mutation detection method and primer based on asymmetric AS2-PCR

The invention discloses an asymmetric AS2 PCR gene mutation detection method based on, comprising the following steps: 1) extracting DNA samples; 2) amplified gene fragments to be tested; 3) the PCR products added to the asymmetric AS2 PCR reaction system, PCR amplification reaction and probe digestion reaction; general label signal probe, AS2 the PCR reaction system containing 2 bands of fluorescence labeled 2 forward primers, 1 reverse primers, exo activity polymerase and PCR buffer; 4) fluorescence signal detection reaction Ct, calculating the difference between the two channels, and determine the gene SNP of tested according to Ct difference. The present invention also discloses the method for asymmetric AS2 PCR oligonucleotide primers group and its use. The present invention by primer design asymmetric AS2 PCR, overcome the false positive rate of the traditional AS2 PCR high, improve the accuracy of gene mutation detection.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及DNA檢測
，特別是涉及組織、血液中的DNA位點(diǎn)突變檢測，更具體地說，是涉及用不對稱AS2-PCR實(shí)時(shí)、定點(diǎn)檢測基因變異的方法，以及該方法所用的引物。
技術(shù)介紹
基因科學(xué)是生物科學(xué)的一個(gè)重要領(lǐng)域，生命體的基因密碼序列及其變異會影響生命體的多種生物功能和功能變異，通過檢測基因SNP(singlenucleotidepolymorphism，單核苷酸多態(tài)性)，可以了解和預(yù)估生命體的功能變異。當(dāng)前，檢測基因SNP已成為分析判斷遺傳病、藥物反應(yīng)特征的重要手段，也是預(yù)測和預(yù)防許多生命疾病的重要手段，例如，糖尿病等內(nèi)分泌疾病，以及各種腫瘤的易感因素。目前，基因SNP的檢測方法主要有毛細(xì)管電泳測序法、Taqman探針法、等位基因特異PCR法(AS2PCR)和通用探針實(shí)時(shí)熒光PCR。毛細(xì)管電泳測序法是基因變異檢測的經(jīng)典可靠方法，但需要使用昂貴的測序儀，檢測成本較高，而且測序儀的操作使用和維護(hù)都比較復(fù)雜，因此大多數(shù)城市的醫(yī)院和科研單位都沒有配備測序儀。Taqman探針法也是一種經(jīng)典方法。Taqman探針法以兩條15—25bp的探針片段中的1個(gè)堿基的微小雜交溫度差異來鑒定目標(biāo)位點(diǎn)的一個(gè)堿基的差異，這種方法的缺點(diǎn)是：1)探針的篩選比較困難，一般一對探針需要經(jīng)過多次篩選，才能選出較為合適的探針，而且經(jīng)常遇到多次篩選不成功的情況；2)檢測一個(gè)基因的SNP需要兩個(gè)特異探針，因此成本較高；3)不是定點(diǎn)識別，因此對單堿基突變檢測的靈敏性和特異性不高，容易出現(xiàn)假陰性或假陽性。等位基因特異PCR法(AS2-PCR)，經(jīng)過人們改良后，其非特異性擴(kuò)增有所降低，但PCR產(chǎn)物的鑒定，如果采用電泳來鑒定大小片段的有無，這種終點(diǎn)檢測，容易將純合型誤判為雜合型，導(dǎo)致假陽性率較高；如果采用熒光法鑒定，就需要采用SYBgreen，并分兩管檢測，比較熒光起跳的循環(huán)數(shù)，這樣帶來了管間差異，也易造成純合型誤判為雜合型，導(dǎo)致假陽性率較高。通用探針實(shí)時(shí)熒光PCR是YuanliZhang等2003年在NucleicAcidsResearch首次提出的方法，涉及的通用探針技術(shù)是在某一普通引物5’端連接一段約20bp的寡核苷酸，這一寡核苷酸稱為通用模板，可以和通用探針互補(bǔ)雜交，而后探針被外切而產(chǎn)生信號。這種方法的缺陷是：1、引物和探針就可觸發(fā)外切而產(chǎn)生信號，產(chǎn)物多時(shí)信號強(qiáng)度高，產(chǎn)物少時(shí)，信號強(qiáng)度也可能高，無產(chǎn)物時(shí)，也可能產(chǎn)生信號，而且起始信號波動較大，加樣時(shí)間到上機(jī)時(shí)間間隔越長，這種影響越大。因此，不能直接或完全反應(yīng)PCR產(chǎn)物的量和性質(zhì)，從而會影響檢測的準(zhǔn)確性。KASP(KompetitiveAlleleSpecificPCR)，即競爭性等位特異性PCR，已有十多年歷史，現(xiàn)已廣泛用于基因變異檢測。其優(yōu)點(diǎn)是采用獨(dú)有的通用探針，在開發(fā)檢測試劑時(shí)，方便快捷，成本低。KASP的原理是：采用2條通用熒光探針、2條通用淬滅探針，1條熒光探針和其對應(yīng)的淬滅探針構(gòu)成1個(gè)組合，共兩個(gè)組合4條探針，再加2條位點(diǎn)特異探針來檢測1個(gè)SNP位點(diǎn)的兩個(gè)類型。具體檢測方法可參見圖1所示：第1步位點(diǎn)特異PCR擴(kuò)增，使用2條帶通用標(biāo)簽的位點(diǎn)特異PCR引物和1條對側(cè)引物進(jìn)行位點(diǎn)特異PCR反應(yīng)，如圖1所示，模板與可互補(bǔ)的(3'末端能配對的)PCR引物進(jìn)行退火，并發(fā)生擴(kuò)增，擴(kuò)增出帶有標(biāo)簽序列的PCR產(chǎn)物，這步完成SNP識別；第2步通用標(biāo)簽探針PCR擴(kuò)增，應(yīng)用2條熒光標(biāo)記通用信號標(biāo)簽特異引物與第1步PCR產(chǎn)物上的標(biāo)簽互補(bǔ)擴(kuò)增，同時(shí)，體系中還有2條淬滅標(biāo)記的片段序列與熒光標(biāo)記通用信號標(biāo)簽引物互補(bǔ)雜交，淬滅熒光信號。經(jīng)過接下來幾輪的PCR擴(kuò)增，一方面淬滅探針被切碎，另一方面熒光引物更多地退火到新合成的、沒有淬滅基團(tuán)的互補(bǔ)鏈上，發(fā)出熒光，通過低溫55度檢測熒光，就可以檢出SNP位點(diǎn)上的堿基類型。這種檢測方法，優(yōu)點(diǎn)是通用探針體系和特異的位點(diǎn)特異引物(帶有標(biāo)簽生成序列)，位點(diǎn)特異引物體系首先起作用，進(jìn)行位點(diǎn)特異PCR反應(yīng)，而后需要通用探針體系中的標(biāo)簽通用引物對帶有標(biāo)簽序列的位點(diǎn)特異PCR的產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，然后探針體系才能產(chǎn)生信號，所以通用探針體系中既是探針體系，又是引物體系。熒光探針也是引物，比淬滅探針長約20bp，其3’端起引物作用。所以是一個(gè)接力PCR反應(yīng)。這種反應(yīng)的缺點(diǎn)是：一是接力PCR比較復(fù)雜，一步操作需要優(yōu)化濃度差，困難較大，容易實(shí)驗(yàn)失敗，或結(jié)果錯(cuò)誤；分步操作就需要外切第一輪的剩余引物，再進(jìn)行第二輪PCR，干擾因素少，但操作復(fù)雜；二是第二輪的PCR引物和探針雜交，在前期時(shí)，探針必然因雜交而被外切產(chǎn)生位點(diǎn)無關(guān)信號，就成了非特異信號，非特異信號越高，越容易判錯(cuò)；三是第一輪PCR和第二輪PCR在多個(gè)循環(huán)中同時(shí)進(jìn)行，相互有干擾，會影響檢測結(jié)果。公開號為CN104404162A、名稱為“采用引物關(guān)聯(lián)通用探針檢測多重基因或不同靶標(biāo)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法”的中國專利申請，采用了通用探針設(shè)計(jì)，其通用探針是與產(chǎn)物雜交，與Kasp方法不同，但仍未擺脫接力PCR的限制，其位點(diǎn)特異引物設(shè)置了三個(gè)區(qū)域，從3’端到5’端約需要60—70bp，分別安排了天然特異引物段、探針序列段和通用引物段。在第1輪擴(kuò)增中不可能產(chǎn)生信號，在第2輪的擴(kuò)增中，第2輪引物從自身的5’端向3’端延伸中外切探針產(chǎn)生信號，信號直接完全與產(chǎn)物關(guān)聯(lián)。該方法的缺點(diǎn)是：1、仍然是復(fù)雜的接力PCR，需要引物濃度差的優(yōu)化；2、有相當(dāng)多的循環(huán)，是兩個(gè)PCR反應(yīng)同時(shí)發(fā)生，優(yōu)化復(fù)雜，容易產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果或?qū)е聦?shí)驗(yàn)失敗。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題之一是提供一種基于不對稱AS2-PCR的基因變異檢測方法，該方法準(zhǔn)確性高，操作簡便，成本低。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)的基于不對稱AS2-PCR的基因變異檢測方法，包括以下步驟：1)提取樣本DNA；2)以所述DNA為模板，擴(kuò)增待測基因片段；3)將步驟2)的產(chǎn)物加入到不對稱AS2-PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行AS2-PCR擴(kuò)增反應(yīng)和探針外切反應(yīng)；所述AS2-PCR反應(yīng)體系含有2條帶熒光標(biāo)記的通用標(biāo)簽信號探針、2條AS2-PCR正向引物、1條AS2-PCR反向引物、有外切活性的聚合酶和PCR緩沖液；所述AS2-PCR反向引物的量多于所述AS2-PCR正向引物的量；4)檢測步驟3)的反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號，計(jì)算兩個(gè)通道的Ct值和Ct差值，根據(jù)Ct差值判斷待測基因的SNP。其中，每條AS2-PCR正向引物包括天然特異序列區(qū)段、標(biāo)簽信號序列發(fā)生區(qū)段和酶結(jié)合點(diǎn)發(fā)生區(qū)段。所述天然特異序列區(qū)段靠近3’端，序列長度為18～28bp，該天然特異序列區(qū)段的序列與待測基因片段預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物(即步驟2)的產(chǎn)物)中的同等長度的一段序列互補(bǔ)。所述標(biāo)簽信號序列發(fā)生區(qū)段位于中間，序列長度為15～25bp，該段序列與所述通用標(biāo)簽信號探針的序列完全相同，作用是在不對稱AS2-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物中形成一段與通用標(biāo)簽信號探針互補(bǔ)的序列。所述酶結(jié)合點(diǎn)發(fā)生區(qū)段靠近5’端，序列長度為5～25bp，GC含量為0～30％，作用是在不對稱AS2-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中形成與所述有外切活性的聚合酶相結(jié)合的部位。所述通用標(biāo)簽信號探針為MGB探針，序列長度為15～25bp，一端標(biāo)記熒光基團(tuán)(FAM、VIC、Rox或Cy5等)，另一端標(biāo)記MGB，起淬滅作用。步驟3)中，每條AS2-PCR正向引本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
基于不對稱AS2?PCR的基因變異檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：1)提取樣本DNA；2)以所述DNA為模板，擴(kuò)增待測基因片段；3)將步驟2)的產(chǎn)物加入到不對稱AS2?PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行AS2?PCR擴(kuò)增反應(yīng)和探針外切反應(yīng)；所述AS2?PCR反應(yīng)體系含有2條帶熒光標(biāo)記的通用標(biāo)簽信號探針、2條AS2?PCR正向引物、1條AS2?PCR反向引物、有外切活性的聚合酶和PCR緩沖液；所述AS2?PCR反向引物的量多于所述AS2?PCR正向引物的量；4)檢測步驟3)的反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號，計(jì)算兩個(gè)通道的Ct值和Ct差值，根據(jù)Ct差值判斷待測基因的SNP。

【技術(shù)特征摘要】
1.基于不對稱AS2-PCR的基因變異檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：1)提取樣本DNA；2)以所述DNA為模板，擴(kuò)增待測基因片段；3)將步驟2)的產(chǎn)物加入到不對稱AS2-PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行AS2-PCR擴(kuò)增反應(yīng)和探針外切反應(yīng)；所述AS2-PCR反應(yīng)體系含有2條帶熒光標(biāo)記的通用標(biāo)簽信號探針、2條AS2-PCR正向引物、1條AS2-PCR反向引物、有外切活性的聚合酶和PCR緩沖液；所述AS2-PCR反向引物的量多于所述AS2-PCR正向引物的量；4)檢測步驟3)的反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號，計(jì)算兩個(gè)通道的Ct值和Ct差值，根據(jù)Ct差值判斷待測基因的SNP。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)，每條AS2-PCR正向引物包括天然特異序列區(qū)段、標(biāo)簽信號序列發(fā)生區(qū)段和酶結(jié)合點(diǎn)發(fā)生區(qū)段，所述標(biāo)簽信號序列發(fā)生區(qū)段的序列與所述通用標(biāo)簽信號探針的序列完全相同。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述天然特異序列區(qū)段靠近3’端，序列長度為18～28bp；所述標(biāo)簽信號序列發(fā)生區(qū)段位于中間，序列長度為15～25bp；所述酶結(jié)合點(diǎn)發(fā)生區(qū)段靠近5’端，序列長度為5～25bp；所述通用標(biāo)簽信號探針的序列長度為15～25bp，一端標(biāo)記熒光基團(tuán)，另一端標(biāo)記MGB。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述酶結(jié)合點(diǎn)發(fā)生區(qū)段GC含量為0～30％。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)，每條AS2-PCR...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：黃新華，戴慧清，李冰，
申請(專利權(quán))人：上海基致生物醫(yī)藥科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31