新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒制造技術

本發(fā)明專利技術公開了一種新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒。本發(fā)明專利技術所述新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，包括：包被新城疫病毒滅活抗原的ELISA板，新城疫病毒陽性對照血清、陰性對照血清，辣根過氧化物酶標記的新城疫病毒NP蛋白單克隆抗體。所述新城疫病毒NP蛋白單克隆抗體由保藏編號為CCTCC?NO：C2016180的雜交瘤細胞株所分泌。本發(fā)明專利技術所述新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒能夠檢測不同種屬來源的疑似新城疫病毒感染的血清樣品，區(qū)分MG7缺失苗免疫和野毒感染后的新城疫病毒血清，且與常見禽類病毒性病原陽性血清不存在交叉反應，檢測敏感性和特異性高，重復性好，適用于高通量檢測血清樣品。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及一種獸醫(yī)學檢測用試劑盒，尤其涉及一種用于新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，屬于新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒的制備領域。
技術介紹
新城疫(NewcastleDisease，ND)是由新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)引起禽類的一種高度接觸性傳染病，該病具有發(fā)病急、死亡快和死亡率高等特點，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重影響?zhàn)B禽業(yè)的發(fā)展。NDV屬于副粘病毒科腮腺炎病毒屬，具有囊膜結(jié)構，基因組為單股負鏈不分節(jié)段的RNA病毒，由6種結(jié)構蛋白組成，分別為NP、P、M、F、HN和L蛋白。NP蛋白為核衣殼蛋白，氨基酸保守性較高，大部分NDV病毒在NP蛋白443-460位置都具有一高度保守的B細胞表位；P蛋白是病毒RNA合成的必需因子；M、F和HN蛋白與病毒囊膜的形成相關；F蛋白(融合蛋白)和HN蛋白(血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白)是病毒的主要免疫原性蛋白，可以誘導機體產(chǎn)生中和抗體。F蛋白介導病毒與宿主細胞的膜融合，其蛋白裂解位點與病毒毒力有關。HN蛋白具有神經(jīng)氨酸酶及促進融合等作用；此外，該蛋白還與病毒毒力相關。L蛋白為病毒最大的蛋白，它在NDV6種結(jié)構蛋白中最為保守，具有RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄后修飾等生物學活性，可與NP和P蛋白共同構成病毒復制復合體，該復合體參與病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復制。NDV只有一個血清型，但其包含兩個Class，分別為ClassI和ClassII，疫苗接種是預防該病的主要措施，且兩個Class毒株具有較好的交叉保護性。對免疫家禽群體進行新城疫病毒抗體檢測是評價疫苗免疫效果、評估易感禽群抗該病毒感染風險的有效手段。現(xiàn)有研究資料表明，新城疫病毒不僅感染雞、鴨、鵝，還可感染鴿子等家養(yǎng)珍禽或野鳥等禽類，因此利用ELISA方法的血清學流行病學調(diào)查對該病的檢測與監(jiān)測至關重要。目前針對新城疫病毒抗體檢測的ELISA方法為間接ELISA，此法只能針對雞或火雞血清樣品。因此，亟待開發(fā)一種新的新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，不僅實現(xiàn)檢測血清的抗體陰陽性，還能夠消除血清樣品種屬來源的差異，檢測方法更加簡單、方便、快速及廉價。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種用于檢測新城疫病毒抗體的阻斷ELISA試劑盒，不僅能夠檢測血清的抗體陰陽性，還可消除血清樣品種屬來源的差異，具有特異性和敏感性高、重復性好，操作簡便、快速等特點。為解決上述技術問題，本專利技術所采取的技術方案是：本專利技術首先公開了一種新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，包括：包被新城疫病毒滅活抗原的ELISA板，新城疫病毒陽性對照血清，新城疫病毒陰性對照血清，辣根過氧化物酶標記的新城疫病毒NP蛋白單克隆抗體；其中，所述新城疫病毒NP蛋白單克隆抗體是由保藏編號為：CCTCCNO：C2016180的雜交瘤細胞株所分泌。其中，所述新城疫病毒陽性對照血清為新城疫病毒滅活疫苗免疫后的雞血清；優(yōu)選為新城疫病毒MG7株(保藏編號：CCTCCV201505)滅活疫苗免疫SPF雞7天、14天和21天后的血清，或者NP18+F新城疫全病毒滅活疫苗免疫后的雞血清；所述新城疫病毒陰性對照血清為SPF雞血清。本專利技術單克隆抗體通過以下方法制備得到：本專利技術利用新城疫病毒MG7株NP蛋白443-460aa位的缺失肽段(GETQFLDFMRAVANGMRE)為抗原，在其C端耦聯(lián)KLH，序列為KLH-Cys-GETQFLDFMRAVANGMRE，合成該多肽后與弗氏完全佐劑乳化后免疫Balb/C小鼠，取小鼠的脾臟分離細胞并和SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，篩選和鑒定陽性細胞。本專利技術從多株單克隆細胞株中篩選出反應較強的單克隆細胞株，其分泌的單克隆抗體8F9H3的效價最高、特異性最強。亞型鑒定結(jié)果表明，單克隆抗體8F9H3為IgG2b亞類。本專利技術將分泌所述新城疫病毒NP蛋白單克隆抗體8F9H3的細胞株提交專利認可的機構進行保藏，其微生物保藏編號為：CCTCCNO：C2016180。保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏時間是2016年10月25日；保藏地址：中國武漢，武漢大學。本專利技術所述的新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，還包括：血清稀釋液、洗液、單組分的底物溶液和終止液。所述血清稀釋液為含0.05％吐溫(V/V)和0.5％BSA(牛血清白蛋白)(mg/ml)的PBS溶液，所述PBS溶液的pH為7.4；所述洗液為PBST溶液；所述底物溶液為TMB(3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺)底物溶液；所述終止液為2MH2SO4。本專利技術所述包被新城疫病毒滅活抗原的ELISA板的制備方法包括：制備新城疫病毒滅活抗原，然后用新城疫病毒滅活抗原包被ELISA板，即得。其中，所述包被的條件為：新城疫病毒滅活抗原的濃度為1ng/μL，100μL/孔，37℃孵育2h或者4℃過夜。所述新城疫病毒滅活抗原的制備包括：將新城疫病毒接種9-10日齡雞胚，37℃孵育，棄掉24h內(nèi)死去的雞胚，收取孵育至72h的雞胚尿囊液，離心，收集上清，用β-丙內(nèi)酯4℃滅活過夜；將滅活后的病毒液離心，收集沉淀，即得。本專利技術對制備抗原的新城疫病毒沒有特殊限制，任何來源的新城疫病毒毒株制備的新城疫病毒滅活抗原均適用于本專利技術。本專利技術所述的新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒能夠應用于檢測新城疫病毒抗體，包括以下步驟：將待檢血清稀釋，100μL/孔加入包被新城疫病毒滅活抗原的ELISA板；同時設置陰性、陽性對照孔，加入稀釋的陰性對照血清、陽性對照血清，100μL/孔；37℃孵育1h；甩干ELISA板，用PBST洗滌3次，用吸水紙拍干；加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的新城疫病毒NP蛋白單克隆抗體，100μL/孔，37℃孵育30min；甩干ELISA板，用PBST洗滌3次，用吸水紙拍干；加入TMB底物溶液，100μL/孔，室溫顯色10min；加入終止液，100μL/孔；選擇OD450nm讀值，計算阻斷率。阻斷率＝(陰性對照OD值-待檢血清OD值)/陰性對照OD值×100％；如果待檢血清的阻斷率≥30％，則判為陽性，如果待檢血清的阻斷率<30％，則判為陰性。本專利技術對新城疫病毒滅活抗原的包被濃度、陰陽性對照血清的稀釋比、待檢血清的稀釋比和HRP標記的新城疫病毒蛋白NP單克隆抗體的稀釋比，進行了優(yōu)化。當兩孔陰性對照OD450nm值至少一孔OD值大于1.0；兩孔陽性對照孔至少一孔的阻斷率大于50％時，最終確定反應條件：用新城疫滅活病毒包被ELISA板(100μL/孔)，抗原濃度為1ng/μL，37℃孵育2h或者4℃過夜；將待檢血清用血清稀釋液按照體積比1：5稀釋；將陰性對照血清、陽性對照血清用血清稀釋液按照體積比1：2稀釋；將辣根過氧化物酶標記的新城疫病毒NP蛋白單克隆抗體用血清稀釋液按照體積比1：1000稀釋。本專利技術將樣品5倍稀釋的OD值換算成反應阻斷率，結(jié)果樣品在5倍稀釋度，阻斷率在30％時陰陽性血清分布交叉最小。因此，本專利技術新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒的閾值定為：樣品在5倍稀釋時阻斷率≥30％，判為陽性；阻斷率<30％時，判為陰性。特異性和敏感性試驗結(jié)果表明，利用本專利技術所述新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒檢測新城疫病毒抗體的敏感本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
一種新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，其特征在于，包括：包被新城疫病毒滅活抗原的ELISA板，新城疫病毒陽性對照血清，新城疫病毒陰性對照血清，辣根過氧化物酶標記的新城疫病毒NP蛋白單克隆抗體。

【技術特征摘要】
1.一種新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，其特征在于，包括：包被新城疫病毒滅活抗原的ELISA板，新城疫病毒陽性對照血清，新城疫病毒陰性對照血清，辣根過氧化物酶標記的新城疫病毒NP蛋白單克隆抗體。2.按照權利要求1所述的新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，其特征在于，所述新城疫病毒NP蛋白單克隆抗體由保藏編號為：CCTCCNO：C2016180的雜交瘤細胞株所分泌。3.按照權利要求1所述的新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，其特征在于：所述新城疫病毒陽性對照血清為新城疫病毒滅活疫苗免疫后的雞血清；所述新城疫病毒陰性對照血清為SPF雞血清。4.按照權利要求1所述的新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，其特征在于，還包括：血清稀釋液、洗液、底物溶液和終止液；所述血清稀釋液為含0.05％吐溫和0.5％BSA的PBS溶液，所述PBS溶液的pH為7.4；所述洗液為PBST溶液；所述底物溶液為TMB底物溶液；所述終止液為2MH2SO4。5.按照權利要求1所述的新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，其特征在于，所述包被新城疫病毒滅活抗原的ELISA板的制備方法包括：制備新城疫病毒滅活抗原，然后用新城疫病毒滅活抗原包被ELISA板，即得。6.按照權利要求5所述的新城疫病毒抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，其特征在于，所述包被的條件為：新城疫病毒滅活抗原的濃度為1ng/μL，100μL/孔，37℃孵育2h或者4℃過夜。7.按照權利要求5所述的新城疫病毒抗體檢測阻斷ELIS...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：朱啟運，賈艷娥，周廣青，吉艷紅，楊麥娟，
申請(專利權)人：中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：甘肅;62