本發明專利技術從耐輻射異常球菌Deinococcus?radiodurans中發現了一種具有聚酮類化合物合成功能的基因Dr2091。本發明專利技術構建了含有該基因的重組載體，將其在原核宿主細胞大腸桿菌中表達。實驗證明，所述基因在原核宿主細胞中表達后，能催化小分子底物進行脫羧縮合反應，可用于微生物催化生物合成。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程
，涉及一種具有聚酮類化合物合成功能的基因。
技術介紹
次生代謝產物是由次生代謝產生，以初級代謝產物為前體的一類細胞生命活動生長發育正常運行非必需的小分子有機化合物。微生物次生代謝產物因其結構與活性的多樣性在醫藥和農業生產上具有廣泛的用途。聚酮類化合物(Polyketides)是一類具有多種結構以及不同生物活性的次級代謝產物。這些代謝產物表現出不同的藥理學特性，包括抗菌，抑制真菌，抗寄生蟲，抗氧化和抗癌等。該類化合物由聚酮合酶(PolyketideSynthase,PKS)通過縮合一系列酰基CoA后環化修飾而成。耐輻射異常球菌(Deinococcusradiodurans)是一類具有超強電離輻射抗性，UV輻射抗性以及抗氧化，抗干燥等非生物脅迫抗性的微生物。1999年完成了耐輻射異常球菌的全基因組測序與基因注釋，其基因組全長約3.28Mbp，包含兩條染色體，長度分別為2,648,638bp和412,348bp，以及一個長度為177,466bp的大質粒和長度為45,704bp的小質粒。整個基因組的G+C％含量約為66.6％，共包含3,187個開放閱讀框架(ORF)，其中次生代謝產物合成基因占整個基因組的3％。DR2091預測為III型聚酮合酶基因，與擬南芥III型聚酮合酶查爾酮合成酶(ArabidopsisthalianaTT4CHS)的一致性僅為為29.96％。細菌III型聚酮合酶的深入研究將有助于進行基因工程、代謝工程的遺傳操作以及新型化合物的合成與應用。
技術實現思路
本專利技術的目的是從耐輻射異常球菌Deinococcusradiodurans中發現一種用于聚酮類化合物合成的聚酮合酶基因。本專利技術通過如下研究，首次發現耐輻射異常球菌Dr2091基因(GeneID：1797604；ProteinID：NP_295814.1)可用于微生物化合物生物合成。具體研究工作如下：1、獲得含有Dr2091基因的重組工程菌株1)通過PCR從耐輻射異常球菌基因組擴增出Dr2091基因，基因序列號為：GeneID：1797604。其大小為1083bp，該基因編碼360個氨基酸，將其克隆于載體pJET上，構建了含有完整Dr2091基因的重組質粒pJET-2091；2)將Dr2091基因連接于pT7-FLAGTM-3穿梭質粒上，該質粒含有能在大腸桿菌中都起作用的T7啟動子，構建含有T7啟動子的完整Dr2091基因重組質粒pT7-FLAG-2091；3)將導入Dr2091基因的重組質粒pT7-FLAG-2091轉入受體大腸桿菌JM109中，獲得工程菌株JM-2091(詳見實施例1)；2、含有Dr2091基因重組工程菌株的化合物合成檢測實驗實驗證實，Dr2091基因在大腸桿菌中誘導表達，含有耐輻射異常球菌Dr2091基因的JM-2091重組菌株能夠合成三酮吡喃酮。此實驗表明：耐輻射異常球菌Dr2091基因具有在微生物中催化小分子化合物發生脫羧縮合反應合成吡喃酮類聚酮化合物功能。序列表信息SEQIDNO.1：Dr2091基因的DNA序列。SEQIDNO.2：Dr2091的氨基酸序列。附圖說明：圖1工程菌株JM-2091與對照菌株JM-F3的產物化合物的HPLC分析。圖2底物化合物和產物1號化合物質譜解析圖；具體實施方式以下實施例中所舉的質粒、菌株以及微生物催化羥基化的對象只用于對本專利技術作進一步詳細說明，并不對本專利技術的實質內容加以限制。凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規條件或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所舉的質粒、菌株來源如下：克隆載體pJET：為ThermoFisher公司市售產品；表達質粒pT7-FLAGTM-3：為Sigma-Aldrich公司市售產品；大腸桿菌JM109：為北京全式金公司市售產品。實施例1耐輻射異常球菌Dr2091基因序列在大腸桿菌中的表達一、實驗方法1.根據已公布的耐輻射異常球菌基因組中的Dr2091基因序列設計1對PCR特異性引物：2091-F：5′CTTGCGGCCGCGATGCGGGCCATGAACGCTG3′2091-R：5′ATCTAGATCTGCTCACGCTTCCCCGCCGCCAA3′2.通過PCR方法從耐輻射異常球菌基因組DNA中擴增出目的基因序列。反應條件：94℃10min，[94℃30sec，60℃30sec，72℃1.5min]35個循環，72℃10min。3.PCR產物經膠回收后，克隆于載體pJET上，命名為pJET-2091，并測序驗證；然后通過NotI/BglII雙酶切獲得含有粘性末端的Dr2091基因及含有T7啟動子的pT7-FLAGTM-3載體，將Dr2091基因連接于pT7-FLAGTM-3載體上，構建大腸桿菌表達載體pT7-FLAG-2091。4.將該表達載體轉化大腸桿菌JM109，經PCR、酶切，測序驗證插入序列正確，將該菌株命名為JM-2091。含有pT7-FLAGTM-3對照空質粒的E.coliJM109命名為JM-F3。二、實驗結果成功構建了表達Dr2091的重組大腸桿菌工程菌株。實施例2含耐輻射異常球菌菌株Dr2091基因重組工程菌株的催化活性實驗一、實驗材料重組工程菌株：實施例1得到的含有Dr2091基因的JM-2091菌株對照菌株：實施例1所述含空質粒的JM-F3菌株。二、實驗方法1.將對照菌株和重組工程菌株在LB固體培養基平板上劃線活化；2.挑取單菌落接種于添加有相應抗生素的100mL液體LB培養基中，37℃培養至OD600為0.6。3.向培養基中加入終濃度0.5mM的蛋白表達誘導物IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和終濃度0.1mM的延伸底物丙二酰輔酶A，20℃繼續培養20小時。4.用6NHCl調節菌液的pH至5.0，加入100mL乙酸乙酯，旋轉混勻提取約10min，室溫下離心10分鐘，收集上層液體。5.向管中加入3mL無菌水，洗滌菌體。轉移菌體至15mL離心管中。4℃，離心10min；棄去上清。6.將上層液體轉移至圓底燒瓶，真空低溫(30℃)蒸餾，除去乙酸乙酯。加1mL甲醇重新溶解提取物。離心10min，取20μL上樣HPLC分析或-80℃冰箱保存備用。7.進行HPLC分析，條件為：流動相：H2O/乙腈；0min，H2O:乙腈＝100:0；30min，H2O:乙腈＝0:100；45min，H2O:乙腈＝0:100。流速0.8mL/min，分析波長主要有300nm，280nm，254nm8.對HPLC分析所得的1號主峰化合物(即1號產物)進行液相色譜-質譜分析(LC-MS)和核磁共振(1H‐NMR和13C‐NMR)分析。三、產物分析HPLC分析結果如圖1顯示，表達耐輻射異常球菌菌株Dr2091基因重組工程菌株JM-2091與含有空質粒的對照菌株JM-F3的產物峰型顯著不同。圖1中重組工程菌株JM-2091在保留時間30分鐘處，出現一系列產物峰。HPLC分析所得1號產物的液相色譜-質譜分析(LC-MS)結果如圖2顯示，該化合物分子量為292。利用核磁共振方法(1H-NMR和13C-NMR)對1號產物結構進行解析，確認該1號產物是4-羥基-6-(十三烷-8’-烯基)-2-吡喃酮)(表本文檔來自技高網...
【技術保護點】
SEQ?ID?NO:1所示序列的基因在微生物催化生物合成中的應用。
【技術特征摘要】
1.SEQIDNO:1所示序列的基因在微生物催化生物合成中的應用。2.權利要求1所述的應用，是作為聚酮合酶，在生物合成中用于聚酮類化合物的催化反應。3.權利要求2所述的應用，所述聚酮化合物催化反應是利用小分子...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張維，周正富，陳明，徐玉泉，林敏，
申請(專利權)人：中國農業科學院生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：北京;11
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