抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA及其干擾重組表達載體、構建方法和應用技術

本發明專利技術公開了抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA，該shRNA為shRNA?Iqcf5?107、shRNA?Iqcf5?257、shRNA?Iqcf5?425或shRNA?Iqcf5?500，它們分別具有序列表ＳEQ.ID.No.1、3、5、7的堿基序列。據此，發明專利技術人還建立了Iqcf5基因的真核表達載體、shRNA干擾重組表達載體及其構建方法。實驗證實，shRNA?Iqcf5?257和shRNA?Iqcf5?500均能有效的干擾小鼠Iqcf5基因的表達，這對于Iqcf5基因功能的研究奠定了基礎，同時也展示了在研究特發性不育癥的病因及男性不育癥靶向治療和男性避孕方面的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于小鼠Iqcf5基因，尤其涉及一種抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA及其干擾重組表達載體、構建方法和應用。
技術介紹
精子發生是一個復雜精細的過程，在此過程中存在著嚴格的同源群現象和周期變化規律，受眾多因素的協同調控。然而，對于哺乳動物精子發生的分子事件人們依然知之甚少。近年來，受各種因素影響，越來越多的人受到不育癥的困擾，其中一半左右是男性不育。相當比例的男性不育癥患者的睪丸不能產生精子，通常被稱為非梗阻性無精子癥(NOA)，多項研究顯示NOA與遺傳有關。因此，近年來與男性不育密切相關的基因突變或多態現象也相繼被發現并日益成為研究熱點。盡管如此，到目前為止，對于精子發生的分子機理依然所知不多。對調控精子發生相關基因的深入研究，不僅有助于闡明特發性不育癥的病因，而且對于男性不育癥靶向治療的發展和男性避孕有重要的理論及應用價值。鈣調蛋白(CaM)是一個鈣離子傳感器，在很多生命活動中發揮重要作用，但其本身并沒有任何酶活性，只是通過與鈣調蛋白結合蛋白相互作用來調節靶蛋白的活性。鈣調蛋白結合蛋白一般都包含三種典型的鈣調蛋白結合結構域，其中一種是在特定位點有保守的異亮氨酸(Ile)和谷氨酰胺(Gln)的IQ結構域(IQmotif)。已知的具有IQ結構域的蛋白在很多生物功能方面發揮重要作用，包括神經元生長蛋白，電壓門控通道，肌球蛋白，磷酸酶，Ras交換蛋白，精子表面蛋白，紡錘體相關蛋白等。研究表明，具有IQ結構域的蛋白在小鼠生殖方面也發揮重要功能。精子表面蛋白SP17具有保守的IQ基序的蛋白，Ying等發現SP17與小鼠的精子穿透和精卵結合過程有關。Harris等發現，Iqcg基因可能與小鼠精子尾部的形態發生有關，Iqcg基因的敲除會導致雄性小鼠不育。Fang等的研究表明Iqcf1基因在雄性小鼠睪丸和附睪中高表達，且特異表達于小鼠睪丸精子和成熟精子的頂體上。Iqcf1基因被敲除的小鼠明顯表現為精子活率下降，頂體反應率下降。Iqcf4基因也被發現高表達于小鼠的睪丸組織中，且特異表達于小鼠睪丸的精母細胞，但Iqcf4基因在雄性小鼠的生殖方面作用的方式還不是很清楚。而Iqcf5蛋白也是包含兩個IQ基序的鈣調蛋白結合蛋白，且與Iqcf1基因具有高度同源性，因此其在雄性小鼠生殖方面可能發揮重要作用。RNAi是基因功能研究的有力工具，可用于研究動物生殖過程中相關基因的調控機制，從而解決體外研究基因功能的問題。但由于動物的繁殖過程要受到諸多因素的影響和調控，其分子機制也不甚明了，而且對于RNAi的具體機制也尚未完全闡明，因此，目前在哺乳動物上應用RNAi技術的效率也不是太高。要提高RNAi的效率還必須不斷摸索，而干擾過程中最關鍵的就是對有效的siRNA序列的選擇。對動物生殖過程分子機制了解的不斷深入才是解決目前由于遺傳等因素造成的雄性不育的根本途徑，因此，必須從分子遺傳學的角度對生殖相關基因進行研究，從而為不育癥的治療奠定基礎。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA及其干擾重組表達載體、構建方法和應用。為解決上述技術問題，本專利技術采用以下技術方案：抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA，該shRNA為shRNA-Iqcf5-107、shRNA-Iqcf5-257、shRNA-Iqcf5-425或shRNA-Iqcf5-500，它們都包含21nt的siRNA正義鏈，9nt的loop環，21nt的反義鏈和終止信號；loop環的堿基序列為TTCAAGAGA；終止信號的堿基序列為TTTTTTT；shRNA-Iqcf5-107的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.1的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.2的堿基序列；shRNA-Iqcf5-257的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.3的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.4的堿基序列；shRNA-Iqcf5-425的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.5的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.6的堿基序列；shRNA-Iqcf5-500的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.7的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.8的堿基序列。上述抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA的干擾重組表達載體，該載體是：pGPU6/GFP/Neo-shIqcf5-107、pGPU6/GFP/Neo-shIqcf5-257、pGPU6/GFP/Neo-shIqcf5-425或pGPU6/GFP/Neo-shIqcf5-500。上述抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA的干擾重組表達載體的構建方法，干擾重組表達載體由合成的shRNA-Iqcf5-107、shRNA-Iqcf5-257、shRNA-Iqcf5-425或shRNA-Iqcf5-500分別克隆入表達載體pGPU6/GFP/Neo中而得。上述抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA在抑制小鼠Iqcf5基因表達方面的應用。上述抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA的干擾重組表達載體在抑制小鼠Iqcf5基因表達方面的應用。上述抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA在制備男性不育癥治療藥物或男性避孕藥物方面的應用。上述抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA的干擾表達載體在制備男性不育癥治療藥物或男性避孕藥物方面的應用。專利技術人設計并制備了抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA，該shRNA為shRNA-Iqcf5-107、shRNA-Iqcf5-257、shRNA-Iqcf5-425或shRNA-Iqcf5-500，它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1、3、5、7的堿基序列，其shRNA的正義鏈和反義鏈模板的5’端分別添加CACC和GATC，來與BbsI和BamHI酶切后形成的粘端互補；另外，shRNA模板中的loop結構選用TTCAAGAGA用來避免形成終止信號，而shRNA的轉錄終止序列則采用T6結構來終止轉錄。據此，專利技術人還建立了Iqcf5基因的真核表達載體、shRNA干擾重組表達載體及其構建方法。實驗證實，shRNA-Iqcf5-257和shRNA-Iqcf5-500均能有效的干擾小鼠Iqcf5基因的表達，這對于Iqcf5基因功能的研究奠定了基礎，同時也展示了在研究特發性不育癥的病因及男性不育癥靶向治療和男性避孕方面的應用前景。附圖說明圖1是小鼠Iqcf5基因融合蛋白表達載體HP362-PBL-PBR-CAG-mCherry-WPRE的結構示意圖。圖2是抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA干擾重組表達載體的結構示意圖。圖3是靶質粒和干擾質粒共轉染293細胞效果圖。具體實施方式一、研究思路和基本步驟利用分子和細胞生物學技術，首先克隆得到小鼠Iqcf5基因全長編碼區，構建了小鼠Iqcf5基因融合蛋白表達載體，設計并構建小鼠Iqcf5基因shRNA干擾載體；然后，采用脂質體轉染方法將小鼠Iqcf5基因融合蛋白表達質粒和其shRNA干擾載體共轉入293T細胞，通過觀察紅色熒光減弱的情況來快速篩選獲得高效抑制小鼠Iqcf5基因的shRNA干擾序列。研究工作包括以下基本步驟：<1>小鼠Iqcf5基因的克隆、融合蛋白表本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA，其特征在于：該shRNA為shRNA?Iqcf5?107、shRNA?Iqcf5?257、shRNA?Iqcf5?425或shRNA?Iqcf5?500，它們都包含2Int的siRNA正義鏈，9nt的loop環，21nt的反義鏈和終止信號；所述loop環的堿基序列為TTCAAGAGA；所述終止信號的堿基序列為TTTTTTT；所述shRNA?Iqcf5?107的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.1的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.2的堿基序列；所述shRNA?Iqcf5?257的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.3的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.4的堿基序列；所述shRNA?Iqcf5?425的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.5的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.6的堿基序列；所述shRNA?Iqcf5?500的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.7的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.8的堿基序列。

【技術特征摘要】
1.一種抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA，其特征在于：該shRNA為shRNA-Iqcf5-107、shRNA-Iqcf5-257、shRNA-Iqcf5-425或shRNA-Iqcf5-500，它們都包含2Int的siRNA正義鏈，9nt的loop環，21nt的反義鏈和終止信號；所述loop環的堿基序列為TTCAAGAGA；所述終止信號的堿基序列為TTTTTTT；所述shRNA-Iqcf5-107的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.1的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.2的堿基序列；所述shRNA-Iqcf5-257的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.3的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.4的堿基序列；所述shRNA-Iqcf5-425的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.5的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.6的堿基序列；所述shRNA-Iqcf5-500的正義鏈具有序列表SEQ.ID.No.7的堿基序列，其反義鏈具有序列表SEQ.ID.No.8的堿基序列。2.根據權利要求1所述抑制小鼠Iqcf5基因表達的shRNA的干擾重組表達載體，其特...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張明，趙秀玲，潘宏，王煥景，濮黎萍，張鵬飛，陳富美，
申請(專利權)人：廣西大學，
類型：發明
國別省市：廣西;45